Общая методология
Экотоксикометрия – раздел экотоксикологии, в рамках которого рассматриваются методические приемы, позволяющие оценить (перспективно или ретроспективно) экотоксичность ксенобиотиков.
Все виды классических количественных токсикологических исследований в полной мере используются для определения экотоксичности ксенобиотиков.
Острая токсичность экополлютантов определяется экспериментально на нескольких видах, являющихся представителями различных уровней трофической организации в экосистеме (водоросли, растения, беспозвоночные, рыбы, птицы, млекопитающие). Агентство по защите окружающей среды США требует при определении критериев качества воды, содержащей некий токсикант, определения его токсичности, по крайней мере, на 8 различных видах пресноводных и морских организмов (16 тестов).
Неоднократно делались попытки ранжировать виды живых существ по их чувствительности к ксенобиотикам. Однако для различных токсикантов соотношение чувствительности к ним живых существ различно. Более того, использование в экотоксикологии «стандартных видов» представителей определенных уровней экологической организации для определения экотоксичности ксенобиотиков с научной точки зрения некорректно, поскольку чувствительность животных, даже близких видов, порой отличается очень существенно.
Зависимость доза-эффект (эпидемиологический подход). Спектры проявлений токсического процесса определяются строением токсиканта. Однако выраженность развивающегося эффекта является функцией количества действующего агента. В качестве вредного агента могут рассматриваться токсичные вещества, биологические субстанции, проникающая радиация и другие повреждающие факторы. В качестве эффектов могут учитываться самые разнообразные признаки. Например, летальный исход, выход показателя за пределы биологической нормы и т.п. Для обозначения количества вещества, действующего на биологический объект, используют понятие – доза (воздействующая доза). Вид повреждающего агента и путь поступления воздействующей дозы могут быть самыми разнообразными. Воздействующую дозу можно непосредственно измерить при помощи технических средств и выразить в соответствующих единицах (мг/кг, мг/м3, грей, кл/кг и т.д.). Например, введение в желудок крысе весом 250 г и кролику весом 2000 г токсиканта в количестве 500 мг означает, что животным введены дозы, равные соответственно 2 и 0,25 мг/кг. Воздействующая доза имеет нормальное распределение и характеризуется средним значением и дисперсией, обусловленной погрешностью ее измерения. Зависимость «доза-эффект» может быть прослежена на всех уровнях организации живой материи: от молекулярного до популяционного. При этом в подавляющем большинстве случаев будет регистрироваться общая закономерность: с увеличением дозы – увеличивается степень повреждения системы; в процесс вовлекается все большее число составляющих еѐ
элементов. В зависимости от действующей дозы практически всякое вещество в определенных условиях может оказаться вредным для организма.
На проявление зависимости «доза-эффект» оказывает существенное влияние внутри- и межвидовая изменчивость организмов. Действительно, особи, относящиеся к одному и тому же виду, существенно отличаются друг от друга по биохимическим, физиологическим, морфологическим характеристикам. Эти отличия в большинстве случаев обусловлены их генетическими особенностями. Еще более выражены, в силу тех же генетических особенностей, межвидовые различия. В этой связи дозы конкретного вещества, в которых оно вызывает повреждение организмов одного и того же и, тем более, разных видов, порой очень существенно различаются. Следовательно, зависимость «доза-эффект» отражает свойства не только токсиканта, но и организма, на который он действует. На практике это означает, что количественную оценку токсичности, основанную на изучении зависимости «доза-эффект», следует проводить в эксперименте на различных биологических объектах и обязательно прибегать к статистическим методам обработки получаемых данных.
Не следует путать соотношение «доза-эффект» с зависимостью «доза-реакция», последняя определяет степень изменения выбранного показателя по сравнению с нормой. Реакция может измеряться либо в абсолютных единицах, либо в относительных (проценты).
При установлении какого-либо критического уровня показателя нормы (контроля) и вычислении частоты его превышения в экспериментальной выборке зависимость «доза-реакция» превращается в зависимость «доза-эффект» или функцию эффективности по заданному признаку. Функция эффективности состоит из совокупности точек. Каждая точка формируется по причине существования у тест-объектов индивидуальных особенностей (индивидуальной чувствительности), что в конечном итоге приводит либо к появлению регистрируемого признака, либо к его отсутствию при воздействии заданной дозы исследуемого фактора.
Наиболее распространенный способ определения зависимости «доза-эффект» в группе состоит в формировании в этой группе подгрупп. Животным, входящим в подгруппу, токсикант вводят в одинаковой дозе, а в каждой последующей подгруппе доза увеличивается. Формирование подгрупп должно осуществляться методом случайных выборок. С увеличением дозы будет увеличиваться часть животных в каждой из подгрупп, у которых развился оцениваемый эффект. Получаемую при этом зависимость можно представить в виде кумулятивной кривой частот распределения, где количество животных с положительной реакци-
ей на токсикант (часть общего количества животных в подгруппе) является функцией дозы (рис. 2).
|
Рис. 2. Типичная кривая доза-эффект для группы животных,
симметричная относительно средней точки (50% ответ). Основные
значения ответа группы на токсикант сосредоточены вокруг
среднего значения
В большинстве случаев график представляет собой S-образную кривую log-нормального распределения, симметричную относительно средней точки. Можно выделить ряд важных характеристик этой кривой, которые целесообразно учитывать при интерпретации получаемых результатов.
1. Центральная точка кривой (значение 50% ответа) или средняя эффективная доза (ЕД50) представляет собой расчетную статистическую величину, которая также имеет нормальное распределение и характеризуется средним значением и дисперсией. Эффективная доза рассчитывается по значениям вероятностей эффекта, и ее дисперсия включает как погрешность воздействовавшей дозы, так и погрешность эффекта. Эффективная доза в каждой точке функции обозначается определенной категорией, соответствующей вероятности эффекта. Если оцениваемый эффект – летальность животных в группе, эта точка обозначается как среднесмертельная доза. Множество эффективных доз собственно и составляют функцию эффективности.
2. Чувствительность большинства животных в популяции близка среднему значению. Интервал доз, включающий основную часть кривой вокруг центральной точки, иногда обозначается как «потенция» препарата.
3. Небольшая часть популяции в левой части кривой «доза-эффект» реагирует на малые дозы токсиканта. Это группа сверхчувствительных
или гиперреактивных особей. Другая часть популяции в правой части кривой реагирует лишь на очень большие дозы токсиканта. Это малочувствительные, гипореактивные или резистентные особи.
4. Наклон кривой «доза-эффект», особенно вблизи среднего значения, характеризует разброс доз, вызывающих эффект. Эта величина указывает, как велико будет изменение реакции популяции на действие токсиканта с изменением действующей дозы. Крутой наклон указывает на то, что большая часть популяции будет реагировать на токсикант примерно одинаково в узком диапазоне доз, в то время как пологий наклон свидетельствует о существенных различиях в чувствительности особей к токсиканту.
Форма кривой и еѐ экстремальные точки зависят от целого ряда внешних и внутренних факторов, таких как состояние механизмов репарации повреждений, обратимость вызываемых эффектов и т.д. Так, токсический процесс может не развиваться до тех пор, пока не истощатся механизмы защиты организма от действующего токсиканта, не наступит насыщение процессов биохимической детоксикации. Точно так же насыщение процессов образования токсичных метаболитов из исходного ксенобиотика может явиться причиной выхода кривой «доза-эффект» на плато.
Традиционно в токсикологии сложилось естественное убеждение в том, что при увеличении дозы яда вероятность появления ожидаемого эффекта должны возрастать, приближаясь к единице. Именно так и проявляется на живых организмах токсическое действие абсолютного большинства вредных веществ и ядов. По этому поводу еще A. Albert (1958) заметил (По: С.В. Криштопенко и др., 2001): «Разве кто-нибудь должен ожидать уменьшения токсического эффекта любой биологически активной субстанции по мере того как концентрация повышается? Тем не менее, на нескольких примерах обнаруживается, где это происходит». В определенных диапазонах испытания доз зависимость «доза-эффект» принимает нелинейный вид и совершенно не поддается математическому анализу при помощи традиционных методов.
По сведениям, приведенным в работе М.Г. Домшлаг (1998), по результатам экологических исследований установлена нелинейная (бимодальная, инвертированная, V-образная, включающая отрезки с суперлинейностью, сублинейностью и линейностью) зависимость «концентрация (доза) – эффект» при воздействии химических мутагенов, токсичных соединений и низкоинтенсивного облучения (По: С.В. Криштопен-ко и др., 2001).
Такое явление получило в токсикологии название «парадоксальной токсичности». Считается, что его происхождение обусловлено одновременной реализацией разных механизмов токсичности и проявлениями защитных реакций организма (например детоксикация вредных веществ). В
этом смысле ничего необычного (парадоксального) в токсодинамике таких агентов нет. В отдельных случаях неизвестны механизмы реализации данных эффектов. Под самим термином «парадоксальная токсичность» следует понимать явление уменьшения вероятности проявления регистрируемого признака (эффекта) в экспериментальной выборке тест-объектов при последовательном увеличении доз вредных агентов.
Термин «парадоксальная токсичность» применяется для характеристики токсикантов. В этом случае, если в качестве регистрируемого признака используются иные показатели, то зависимость «доза-эффект» определяется общим термином «парадоксальная эффективность».
Парадоксальная функция эффективности является частным случаем зависимости «доза-эффект». В двумерной системе координат она в каждой точке отражает вероятность появления регистрируемого признака при воздействии испытанной дозы. На оси абсцисс фиксируются испытанные дозы, а на оси ординат – вероятности (частоты) эффектов после воздействий этих доз. Признак учитывается в альтернативной форме (1 – есть проявление признака, 0 – нет проявления признака) с использованием терминов «частота» и «вероятность» эффекта.
Частота эффекта – это относительная величина, выраженная в долях единицы или в процентах и найденная экспериментально путем отношения числа тест-объектов, у которых проявился указываемый признак, к общему числу тест-объектов в экспериментальной группе.
Вероятностью эффекта называется прогнозируемая относительная величина, вычисленная при помощи статистических методов и также выраженная в относительных единицах или в процентах. Например, для перевода значений частот эффектов в величины вероятностей применяется формула Ван-ден-Вердена:
P = n +1/ N +2,
где n – число объектов в выбранной группе,
N – общее число объектов в исследованной выборке животных.
Количественное значение частоты эффекта характеризует вероятность встречаемости в экспериментальной выборке тест-объектов индивидуумов с выраженной чувствительностью к заданной дозе исследуемого агента. Именно у этой категории тест-объектов и регистрируются заданные признаки. При увеличении дозы соотношение чувствительных тест-объектов уже в новых экспериментальных выборках могут изменяться, что и является причиной формирования вида функции эффективности. При равномерном увеличении числа чувствительных тест-объектов с возрастанием доз формируется линейная функция эффективности. В противном случае вид функции эффективности может быть самым различным, в том числе и убывающим при возрастании доз, то есть парадоксальном.
зо
В современной токсикометрии проблема оценки феномена парадоксальной токсичности состоит в том, что до настоящего времени не разработано адекватной математической модели, на основе которой было бы возможно осуществлять планирование эксперимента и обработку полученных данных, доказывающих наличие или отсутствие парадоксальных эффектов. Классические методы построения функции эффективности и определения категорий эффективных доз непригодны в том случае, если функция эффективности отличается от функции нормального распределения.
Зависимость «доза-эффект» по показателю летальность. Поскольку смертельный исход после действия токсиканта – альтернативная реакция, реализующаяся по принципу «все или ничего», этот эффект считают наиболее удобным для определения токсичности веществ, его используют для определения величины среднесмертельной дозы (ЛД5 0 (LD50)). Средняя смертельная доза (или концентрация LC50) – количество яда, вызывающее гибель 50% стандартной группы подопытных животных при определенном сроке последующего наблюдения.
Определение острой токсичности по показателю «летальность» проводится методом формирования подгрупп. Введение токсиканта осуществляется одним из возможных способов (например, для крыс, мышей – энтерально, парентерально) при контролируемых условиях.
При этом необходимо учитывать, что способ введения вещества самым существенным образом сказывается на величине токсичности (табл. 3).
Таблица 3
Дата добавления: 2015-02-05 | Просмотры: 8843 | Нарушение авторских прав
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 |
|