АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Клеточная мембрана и внутриклеточные орагнеллы прокариот

для большинства прокариот ЦПМ – это единственная мембрана клетки. У некоторых бактерий и архей она может внедряться внутрь цитоплазмы, образуя выросты и складки различной формы.

ЦПМ всех клеток построены по одному принципу и состоят из простых фосфолипидов, образующих мембранный бислой, куда погружены многочисленные белки.

Большинство биологических мембран имеют толщину от 4 до 7 нм.

ЦПМ обладает избирательной проницаемостью, препятствуя свободному продвижению большинства веществ внутрь и из клетки, и регулирует потоки питательных веществ и метаболитов. Наличие гидрофобного слоя, образованного мембранными липидами, препятствует прохождению через нее любых полярных молекул и макромолекул. Это свойство позволяет клеткам, существующим в большинстве случаев в разбавленных растворах, удерживать полезные макромолекулы и метаболические предшественники.

ЦПМ осуществляет транспорт питательных веществ внутрь клетки и продуктов метаболизма из клетки. Обычно прокариоты имеют значительное число очень специфических транспортных систем. Для переноса структурных компонентов клеточной поверхности и других секретируемых факторов мембрана содержит экспортную систему. В мембране прокариот сосредоточены многие метаболические процессы. ЦПМ играет значительную роль в движении, росте и делении клеток.

Химический состав и строение клеточной стенки - важный систематический признак, по которому все прокариоты подразделяются на следующие группы: грамположительные, грамотрицательные и не имеющие клеточной стенки. В отличии от бактерий археи не синтезируют пептидогликан, но некоторые из них образуют псевдомуреин. Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке до 40 раз больше муреина (пептидогликана) по сравнению с грамотрицательными, однако у них отсутствует внешняя мембрана. Клеточная стенка – это высокоорганизованная клеточная структура, выполняющая множество функций. Она противостоит высокому осмотическому давлению и определяет форму клетки. У бактерий основным опорным элементом клеточной стенки является пептидогликан (муреин), формирующий замкнутый мешок. Этот сетчатый гетерополисахарид состоит из цепей двух чередующихся аминосахаров - N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, сшитых между собой β-1,4-гликозидными связями. Полисахаридные цепи связаны поперечными пептидными мостиками. Некоторые археи содержат аналогичный по архитектуре биополимер (псевдомуреин), состоящий из других исходных материалов.

Из-за разницы в структуре клеточных стенок микроорганизмы по-разному выглядят на препаратах при способе окраски, предложенном датским микробиологом Хансом Грамом: грамположительные удерживают генцианвиолет при обработке спиртом, а грамотрицательные обесцвечиваются.

Типичные грамположительные микроорганизмы формируют толстый, многослойный муреиновый мешок (20-50 нм). Грамотрицательные бактерии обладают более сложной клеточной оболочкой, имеющей внешнюю мембрану, состоящую из двух неодинаковых слоев. Ее внутренний слой составлен фосфолипидами, а внешний – липополисахаридами (ЛПС). ЛПС образуют на поверхности клетки отрицательный заряд и часто являются токсичными. Они имеют сложное химическое строение и обладают антигенными свойствами. По сравнению с ЦПМ внешняя мембрана более инертна метаболически и содержит меньше белков. Эти белки обеспечивают транспорт различных веществ, участвуют в сборке поверхностных структур и конъюгации, способствуют экскреции ферментов в окружающую среду. Внешняя мембрана содержит белки-порины, формирующие поры. ВМ обладает избирательной проницаемостью и участвует в контакте клеток между собой и с поверхностью неживых предметов. Она удерживает ряд внешних структурных образований, например, пили.

Между цитоплазматической и внешней мембранами возникает уникальное образование, называемое периплазматическим пространством (периплазмой). Муреиновый мешок встроен в периплазму и состоит всего лишь из одного слоя (~3 нм толщиной). Наличие дополнительного барьера проницаемости в виде внешней мембраны позволяет уменьшить толщину муреинового слоя и дает возможность эффективно использовать ценные продукты метаболизма муреина, которые накапливаются в периплазматическом пространстве клетки при ее росте

На поверхности прокариотической клетки часто присутствуют нитевидные образования белковой природы (пили, или фимбрии). Они отвечают за прикрепление клетки к неживому объекту и к другой клетке, помогают принимать и передавать ДНК при конъюгации, служат акцепторами бактериофагов.

Размер пилей варьирует от 0,1 до 20 мкм в длину и от 2 до 11 нм в диаметре. Встречаются пили различной архитектуры: от тонких нитевидных до толстых прочных палочкообразных с осевыми отверстиями. Пили могут располагаться перитрихиально или только на конце клетки. Одна клетка может иметь фимбрии разных типов.

Поверх клеточных стенок многих прокариот можно обнаружить слизистые капсулы и чехлы разной толщины. Чаще всего их основой являются полисахариды, реже - гликопротеиды и полипептиды. Капсулы в отличие от чехлов имеют значительную толщину и состоят из более диффузного материала. Поверхность колоний клеток с капсулами выглядит гладкой, влажной и блестящей. Основная роль капсул для патогенных видов – предохранение клетки от узнавания и поглощения фагоцитами. Считается также, что капсулы играют защитную роль, затрудняя диффузию вредных веществ из окружающей среды и способствуя сохранению влаги при высушивании. Материал капсулы может быть долговременным запасом питательных веществ в условиях голодания.

У некоторых прокариот обнаружены регулярно структурированные S-слои, выстилающие наружную поверхность клеточной оболочки равномерно упакованными белковыми образованиями правильной формы. У грамотрицательных бактерий S-слои прилегают непосредственно к внешней мембране, у грамположительных – ассоциированы с поверхностью пептидогликана. S-слои защищают клетку от флуктуаций рН и резких изменений концентраций каких-либо ионов, осмотического стресса, от действия ферментов или бактерий-хищников вроде Bdellovibrio. Наличие S-слоя у патогенного микроорганизма повышает его вирулентность, так как помогает ему справиться с атакой комплемента и избежать фагоцитоза.

В прокариотической клетке различают две области – цитоплазму и ядерную зону. Цитоплазма представляет собой сложную смесь участвующих в метаболизме и инертных соединений, а также является местом ферментативных реакций. В цитоплазме прокариот лежат рибосомы. Они меньше рибосом эукариотической клетки, но сходны с рибосомами ее органелл. Цитоплазма может содержать включения и запасные вещества. Включения – это различные мембранные пузырьки, трубочки, плоские мешочки, образованные инвагинациями цитоплазматической мембраны. К таким структурам относят мезосому, точные функции которой до сих пор неясны. Считается, что она может играть роль в делении клетки, образуя септу, а затем и поперечную перегородку, а также служить местом прикрепления микробной хромосомы, участвуя в репликации и последующем расхождении дочерних клеток. Мезосомы могут также принимать участие в процессах секреции. Однако некоторые исследователи считают, что мезосома – это артефакт, возникающий при фиксации клеток для электронной микроскопии. Многие фототрофные, нитрифицирующие и метанокисляющие микроорганизмы имеют развитую сеть внутрицитоплазматических мембран, совершенно отличную от мезосом. Для прокариот характерно, что вся эта система представляет собой выросты ЦПМ и всегда с ней связана.

В некоторых клетках содержатся сигарообразные газовые вакуоли (аэросомы), окруженные белковой оболочкой и выполняющие у водных организмов роль регуляторов плавучей плотности. У микроорганизмов, использующих углекислый газ как источник углерода, могут присутствовать карбоксисомы, являющиеся вместилищами ключевого фермента цикла Кальвина. Карбоксисомы покрыты тонкой мембраной белковой природы. Некоторые спорообразующие бактерии (например, Bacillus thuringiensis) могут содержать параспоральные тельца белковой природы, токсичные для отдельных видов насекомых.

Многие микроорганизмы откладывают внутриклеточно различные запасные вещества (полисахариды, поли-β-гидроксибутират, полифосфаты, сера и др.). Все запасные вещества присутствуют в клетке в химически инертной форме.

В 1956 г внутри бактериальных клеток была обнаружена "ядерная зона", или нуклеоид, где размещена бактериальная хромосома. В середине 60-х годов было установлено состояние суперскрученности бактериальной ДНК, а затем в течение 10 лет были обнаружены ферменты, которые отвечают за ее сверхспирализацию и раскручивание (топоизомеразы, гиразы). В 70-х годах стало возможным выделение компактной формы тотальной ДНК из клеток бактерий.

По представлениям молекулярной биологии прокариотическая хромосома содержит в своем составе большие молекулы ДНК как носители генетической информации, молекулы иРНК, транскрибируемые с определенных генов, и набор обслуживающих белков-ферментов. Они выполняют функции репарации, участвуют в репликации и транскрипции, а также скручивают и правильно складывают ДНК внутри клетки.

Прокариотическая ДНК обнаружена в кольцевой и линейной формах. ДНК в виде кольцевой молекулы присутствует у большинства прокариот.

У значительного количества микроорганизмов наряду с основной хромосомой обнаружены плазмиды. Это кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые могут существовать и реплицироваться как независимо от бактериальной хромосомы, так и быть интегрированными в нее. Плазмиды не являются обязательным для клетки элементом, хотя могут давать определенные преимущества. Известно, что плазмиды могут нести гены устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам, различным лекарственным препаратам, гены факторов патогенности, гены, определяющие дополнительную метаболическую активность.

7. организация генетического материала в клетке бактерий

Наследственный аппарат бактерий представлен одной хромосомой, которая представляет собой молекулу ДНК, она спирализована и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране. На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены.

Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов, являются:

1) IS-последовательности;

2) транспозоны;

3) плазмиды.

IS-последовательности – это короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки).

Транспозоны – это более крупные молекулы ДНК. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген. Транспозоны способны перемещаться по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии генов. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы (автономно), но неспособны к автономной репликации.

Плазмиды – дополнительный внехромосомный генетический материал. Представляет собой кольцевую, двунитевую молекулу ДНК, гены которой кодируют дополнительные свойства, придавая селективные преимущества клеткам. Плазмиды способны к автономной репликации, т. е. независимо от хромосомы или под слабым ее контролем. За счет автономной репликации плазмиды могут давать явление амплификации: одна и та же плазмида может находиться в нескольких копиях, тем самым усиливая проявление данного признака.

В зависимости от свойств признаков, которые кодируют плазмиды, различают:

1) R-плазмиды. Обеспечивают лекарственную устойчивость; могут содержать гены, ответственные за синтез ферментов, разрушающих лекарственные вещества, могут менять проницаемость мембран;

2) F-плазмиды. Кодируют пол у бактерий. Мужские клетки (F+) содержат F-плазмиду, женские (F—) – не содержат. Мужские клетки выступают в роли донора генетического материала при конъюгации, а женские – реципиента. Они отличаются поверхностным электрическим зарядом и поэтому притягиваются. От донора переходит сама F-плазмида, если она находится в автономном состоянии в клетке.

F-плазмиды способны интегрировать в хромосому клетки и выходить из интегрированного состояния в автономное. При этом захватываются хромосомные гены, которые клетка может отдавать при конъюгации;

3) Col-плазмиды. Кодируют синтез бактериоцинов. Это бактерицидные вещества, действующие на близкородственные бактерии;

4) Tox-плазмиды. Кодируют выработку экзотоксинов;

5) плазмиды биодеградации. Кодируют ферменты, с помощью которых бактерии могут утилизировать ксенобиотики.

Потеря клеткой плазмиды не приводит к ее гибели. В одной и той же клетке могут находиться разные плазмиды.

Воспроизведение генетического материала бактерий осуществляется в процессе репликации, которая у бактерий протекает по полуконсервативному механизму. Это означает, что каждая из двух цепочек ДНК хромосомы или плазмиды служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепочки ДНК. В процессе репликации участвует комплекс ферментов. Репликация начинается с момента расплетения двунитевой структуры ДНК, которое осуществляется ферментом ДНК-гидролазой. При этом формируются две репликативные вилки, которые двигаются в противоположных направлениях, пока не встретятся. Формирование новой дочерней цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Особенностью функционирования ДНК-полимеразы является ее способность присоединять комплементарные матрице нуклеотиды к свободному 3 ' -концу растущей цепочки. Поэтому для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов на матрице родительской цепочки ДНК-полимеразе требуется затравка, которая называется праймером (от англ. primer - запал). Праймер представляет собой короткую нуклеотидную цепочку, комплементарную матричной цепочки со свободным 3 ' -концом. На этом свойстве ДНК-полимеразы основана полимеразная цепная реакция (ПЦР), широко используемая в диагностике инфекционных заболеваний. Две цепи двойной спирали ДНК комплементарны друг другу. На каждой цепи из структурных элементов ДНК - дезоксирибонуклеозидтрифосфатов - синтезируется новая цепь; при этом с каждым из оснований спаривается комплементарное ему основание, так что каждая из двух новых цепей будет комплементарна родительской цепи. Обе новые двойные цепи состоят из одной родительской и одной вновь синтезированной цепи. Такая точная репликация ДНК гарантирует сохранение генетической информации. ДНК бактерий, будучи носителем наследственной информации, сама не служит матрицей для синтеза полипептидов. Биосинтез белков происходит на рибосомах, которые непосредственно с ДНК не соприкасаются. Передачу записанной в ДНК информации к местам синтеза белка осуществляет матричная или информационная РНК (мРНК). Она состоит из одной цепи и отличается от одиночной цепи ДНК тем, что тимин (Т) в РНК заменен урацилом (U). мРНК синтезируется на одной из цепей ДНК, причем механизм этого процесса сходен с механизмом репликации ДНК. Образование мРНК начинается на 5 ' -конце, и по последовательности оснований ее цепь комплементарна цепи ДНК. Этот процесс называется транскрипцией, а перевод нуклеотидной последовательности в последовательность аминокислот - трансляцией. Каждый ген представлен определенным участком молекулы ДНК. Специфическая информация, содержащаяся в гене, определяется последовательностью оснований в цепи ДНК. Специфичность ферментных белков, синтез которых контролируют гены, определяются последовательностью аминокислот в полипептидных цепях. Эта же последовательность определяет и пространственную структуру белка - конформацию. Так растет полипептидная цепь по мере продвижения рибосомы вдоль мРНК. Одновременно происходит закручивание этой цепи и свертывание ее в клубок, определяемое последовательностью аминокислот и природой их боковых цепей (гидрофобные и гидрофильные группы), и в результате возникает структура, обусловливающая специфические свойства и функцию данного белка. К мРНК обычно прикрепляется несколько рибосом, так что на одной и той же матрице одновременно синтезируется несколько полипептидных цепей. На конце мРНК находится кодон, от которого зависит отделение сформированной полипептидной цепи от рибосомы. Т.о., нуклеотидная последовательность ДНК представляет собой закодированную «инструкцию», определяющую структуру специфического белка. Этот универсальный процесс передачи информации при репликации ДНК, транскрипции и трансляции применим как к эукариотам, так и к прокариотам.

8. Фенотипическая изменчивость бактерий

Фенотипическая изменчивость является не наследуемым типом изменчивости, т. е. это различия между микроорганизмами, одинаковыми по генотипу. Эта изменчивость возникает в результате постоянного воздействия на клетку изменяющихся факторов среды обитания. Сходные по генотипу, микроорганизмы могут существенно различаться по фенотипу, т. е. по способу проявления наследственных признаков.

На формирование фенотипа существенное влияние оказывают факторы внешней среды. Известно, что генотипически идентичные организмы в различных условиях существования в определенной степени различаются по своим признакам. Например, изменение содержания жира в молоке животных или массы тела в зависимости от их кормления, изменение количества эритроцитов в крови в зависимости от порциального давления кислорода.

В отличает от особей высший организмов, у которых исследуются признаки каждой особи, у микроорганизмов изучают не признаки одной клетки, а всей культуры, которая включает миллиарды бактерий. Культуры микробов, выращенные на питательной среде, отличаются характером роста, физиологическими и биохимическими признаками. К морфологическим признакам относят окраску, размер, форму, наличие жгутиков, капсул, спор и т. д. К физиологическим признакам культур относятся способность расти при определенной температуре, устойчивость к химическим веществам, облучению, антибиотикам, фагам, различным ядам.

Примером модификационной изменчивости у микроорганизмов может быть образование различных типов адгезинов у гонококка, необходимых для колонизации им кишечника. В качестве примера, можно привести увеличение сальмонелл при добавлении к питательной среде стрептомицина. При переносе таких сальмонелл в питательную среду без стрептомицина бактериальные клетки приобретают типичную для вида величину.

Модификации представляют собой изменения, которые поддерживаются пока действует неблагоприятный фактор. Так, образование L-форм бактерий, лишенных клеточной стенки, происходит под влиянием химиотерапевтических веществ (пенициллина, стрептомицина и т. д.). при снятии действия антибиотиков на культуру бактерий происходит реверсия микроорганизмов в исходные формы. Фенотипическое проявление признака под влиянием условий внешней среды возможно в определенных пределах, называемых нормой реакции, которая допустима генотипом организмов. Некоторые признаки характеризуются широкой нормой реакции. В основном, это количественные признаки (масса микробной клетки, ее величина, пигментация колоний).

Фенотипическое проявление информации, заключенной в генотипе, характеризуется показателями пенентрантности и экспрессивности. Пенетрантность отражает частоту фенотипического проявления имеющейся в генотипе информации, а экспрессивность характеризует степень выраженности признака.

Различают длительную модификацию, которая проявляется в течение нескольких поколений и кратковременную, при которой изменения исчезают при исчезновении действующего фактора внешней среды.

Генотипическая изменчивость бактерий

Генотипическая изменчивость связана с изменением генотипа бактерий. В основе генотипической изменчивости лежат мутации и рекомбинации.

Мутации (от латинского mutatio – изменение) – это изменения структуры ДНК (качественные или количественные), которые возникают под влиянием эндогенных или экзогенных факторов и проявляются наследственно закрепленным изменением одного или многих признаков. В природе мутации возникают без участия экспериментатора и называются спонтанными, а мутации, контролируемые экспериментатором, называются индуцированными. Бактерии с измененными признаками называют мутантами. Спонтанные мутации возникают под влиянием неизвестных причин и лежат в основе эволюции микроорганизмов. Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами. Различают физические, химические и биологические мутагены.

К физическим мутагенам относятся такие факторы, как температура, радиация, ультрафиолетовые лучи, ионизирующие излучения и др.

К химическим мутагенам принадлежат многочисленные химические соединения и вещества, которые могут изменять структуру генов, взаимодействуя с ДНК бактериальной клетки.

Биологическими мутагенами являются бактериофаги и продукты жизнедеятельности клеток, которые накапливаются в питательной среде в результате размножения и роста бактерий.

По широте изменений генома бактерий мутации делят на генные – изменения регистрируют в пределах одного гена, хромосомные – в группе генов, точковые – в одном триплете.

В зависимости от взаимодействия мутагенов на нуклеотид бактериальной клетки или ее плазмиды, мутации делят на нуклеоидные и плазмидные.

По направлению выделяют прямые и обратные мутации. Прямые – это изменения генов бактерий, выделенных из естественной среды обитания. Обратные мутации – это возврат от измененного типа бактерий к естественному типу.

По фенотипическому проявлению различают нейтральные, условно-летальные и летальные мутации.

Нейтральные мутации фенотипически не проявляются. Условно-летальные мутации ведут к изменению, но не к исчезновению функциональной активности фермента. Летальные – это мутации, ведущие к полной потери способности клетки синтезировать жизненно необходимые ферменты, что приводит к ее гибели.

Мутации фенотипически проявляются изменением морфологических, биохимических, вирулентных и других свойств.

Диссоциация – это особый, присущий только бактериям вариант изменчивости, при котором происходит культуральная изменчивость, т. е. расщепление вида и возникновение при росте на плотной питательной среде двух основных типов колоний: S-форма – гладкие (от английского smooth – гладкий) и R-форма (от английского rough – шероховатый) – шероховатые. Между этими формами имеются и переходные М-, О-, Д-формы.

Микроорганизмы из колоний в S-форме обладают хорошо выраженными антигенными и вирулентными свойствами и, напротив, у бактерий из колоний в R-форме эти свойства выражены слабо. Однако, не всегда S-форма микробов является свидетельством их вирулентности. Например, возбудитель сибирской язвы, туберкулеза, чумы вирулентны в R-форме.

В основе диссоциации лежат мутации, спонтанно возникающие в естественной среде обитания микробов или же при культивировании их на искусственных питательных средах.

Диссоциация имеет большое значение для микроорганизмов, так как они, благодаря этому явлению, получают селективное преимущество, обеспечивающее их существование в организме животных и человека, а также во внешней среде. Известно, что S-формы более устойчивы к фагоцитозу, R-формы – к факторам естественной среды обитания.

Геном бактерий способен к репарации. Репарация – это процесс восстановления структуры поврежденной ДНК, который обеспечивается многочисленными ферментами, определяющими состояние этой кислоты. Например, фоторепарация зависит от фотолиаз. Эти ферменты активизируются при образовании тиминовых димеров в ДНК под воздействием ультрафиолетового облучения и деполизируют эти димеры до исходных мономеров.

Наибольшее значение в жизнедеятельности микроорганизмов имеет SOS-репарация или SOS-ответ. SOS-ответ – это реакция микробных клеток на прекращение синтеза нуклеиновых кислот в связи с повреждением ДНК, голоданием клетки, воздействием продуктов метаболизма и т. д. SOS-ответ возникает при критическом состоянии клетки, на грани ее гибели, как реакция направленная на восстановление жизнедеятельности клетки. Например, результатом SOS-ответа у E. Coli является синтез около 25 белков, имеющих непосредственное отношение к репарации, рекомбинации и синтезу ДНК. SOS-ответ у микроорганизмов контролируется SOS-областью. Обычно гены этой области находятся в неактивном состоянии и активизируются лишь в критические для жизни клетки моменты. SOS-репарация обеспечивает развитие микробной популяции в целом и ее адаптацию к изменившимся внешним условиям.

Кроме мутаций у бактерий известны рекомбинационная изменчивость. Рекомбинация – это передача генетического материала от клетки-донора с одним генотипом к клетке-реципиенту с другим генотипом. В результате такой передачи образуются рекомбинанты – т. е. бактерии, обладающие свойствами обоих родителей. Рекомбинация является важнейшим фактором эволюции, т. к. между разными особями происходит обмен генетической информацией, что повышает уровень их приспосабливаемости к различным внешним факторам окружающей среды. Рекомбинации могут наблюдаться на уровне любых живых организмов – от прокариот до высших эукариот.

Различают следующие способы рекомбинационной (комбинативной) изменчивости: трансформация, трансдукция, конъюгация.

Трансформация (от латинского transformo – превращать, преобразовывать) – изменение генома бактерий – реципиента, в результате поглощения из среды свободного фрагмента ДНК клетки-донора.

Впервые явление трансформации начал изучать Ф. Гриффитс (1928), используя в опытах культуры пневмококков. Эти микроорганизмы способны к диссоциации и образуют на плотной питательной среде колонии в S-форме и R-форме. Микроорганизмы образующие S-формы колоний капсульные, они патогенны для белых мышей. Бактерии, формирующие на агаре R-формы колоний бескапсульные, не патогенные для мышей. Фактором патогенности у пневмококков является капсула, что было учтено Ф. Гриффитсом при проведении опытов. Он ввел мышам вместе две культуры пневмококков: одну – непатогенную бескапсульную (R-штамм), а вторую – патогенную с капсулой (S-штамм), но обезвреженную нагреванием. Мыши, получившие смесь упомянутых культур пали. Из крови павших мышей была получена культура, микроорганизмы которой имели капсулу и обладали патогенностью. Контрольные эксперименты продемонстрировали, что введение мышам по отдельности живых пневмококков бескапсульных и убитых нагреванием не приводит к гибели животных. Ученый сделал вывод, что непатогенные клетки R-штамма могут трансформироваться в патогенные пневмококки, обладающие капсулой.

Грачевой (1946) был получен вариант кишечной палочки с некоторыми свойствами характерными для сальмонелл. Она культивировала E. Coli на среде, к которой добавлялась убитая культура сальмонелл.

В результате многочисленных экспериментов было установлено, что путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: синтез капсульного полисахарида, синтез различных ферментов, устойчивость к антибиотикам и т. д.

Было обнаружено, что трансформация имеет место чаще в пределах одного вида, но может наблюдаться и между разными видами. В процессе трансформации участвуют две бактериальные клетки: донор и реципиент.

О. Эвери, К. Мак-Леод, М. Мак-Карти (1944) установили, что трансформирующим фактором является ДНК. По их мнению, трансформация представляет собой поглощение изолированной ДНК бактерии донора клетками бактерии реципиента.

Трансформация – сложный биологический процесс, который протекает поэтапно. Первая стадия этого процесса заключается в адсорбции трансформирующей ДНК на поверхности микробной клетки. Вторая – проникновение ДНК через определенные рецепторные участки стенки бактерии-реципиента при помощи специальных белков внутрь клетки. Третья стадия представляет собой спаривание части ДНК донора с ДНК реципиента, четвертая – включение в ДНК реципиента одной из цепей трансформирующего элемента. И пятая – изменение нуклеотида клетки-реципиента в ходе ее последовательных делений. Способность бактерий реципиентов к трансформации была названа компентентностью. Компентентность определяется физиологическим состоянием клетки-реципиента к периодам клеточного цикла.

Трансдукция (от латинского transductio – перенос) – перенос генов из одной бактериальной клетки в другую при помощи бактериофага. Явление трансдукции впервые установили Н. Циндлер и ДЖ. Ледербер (1952). Для исследований они использовали патогенные для белых мышей два штамма S. typhimurium (22 A и 2A). Штамм 22 А – ауксотрофный, не способный синтезировать триптофан (Т^-), штамм 2А – способный к синтезу триптофана (Т⁺). В опытах исследователи использовали U-образную трубку, разделенные на изгибе бактериальным фильтром. В одно колено этой трубки с питательной средой засевали бактерии штамма 22 А, в другое – штамма 2А. Опыты показали, что штамм 22 А был лизогенен по фагу Р-22. Этот фаг из лизогенной культуры проходил через бактериальный фильтр, лизировал бактерии штамма 2А, присоединял при этом его генетический материал. Затем фаг возвращался обратно и передавал генетический материал штамма 2А штамму 22А, который приобретал способность синтезировать триптофан.

Явление трансдукции установлено не только у сальмонелл, но и у кишечной палочки и актиномицетов. У бактерий наблюдается трансдукция одного, реже двух и весьма редко трех сцепленных генов.

Различают следующие виды трансдукции: общую (неспецифическую), специфическую и абортивную.

Общая трансдукция характеризуется тем, что фаг играет роль переносчика генетического материала бактерий, т. е. передает в клетку-реципиент любой ген донорской клетки. Сам фаг в нуклеоид реципиента не встраивается и лизогении бактериальной культуры не происходит. Один и тот же фаг может служить трансдуктором различных признаков: ферментативной активности, устойчивости к лекарственным веществам, подвижности, вирулентности и др.

Специфическая трансдукция заключается в том, что бактериофаг переносит от клетки-донора в клетку-реципиента строго определенные гены и встраивает их в определенные участки реципиента. Бактериофаг может встраиваться в нуклеоид клетки-реципиента. Клетки бактерий, имеющие в своей хромосоме профаг, называют мезогенными, а явление совместного существования ДНК бактерий и профага называется мезогенным.

Абортивная трансдукция характеризуется тем, что фрагмент ДНК донора, перенесенный в клетку реципиента не включается в ее нуклеоид, а может сохраняться в цитоплазме клетки. Клетка при этом не подвергается лизису, но при делении ее перенесенный новый признак постепенно исчезает у ее потомства.

Конъюгация (от латинского conjugatio – контактирование) – перенос генетического материала от одной бактериальной клетки (донора) к другой (реципиенту) при непосредственном контакте этих клеток. Явление конъюгации открыли Дж. Ледерберг и Э. Татуш (1946).

Ученые взяли два ауксотрофных мутантных штамма E. Coli к-12: один не способный синтезировать треонин и лейцин (Thr-Leu^-), другой – метионин и биотин (Met-Bio^-) и выращивали их вместе в течение 12 часов на полноценной питательной среде. Затем выросшую культуру отцентрифугировали и отмыли от полноценной питательной среды и засеяли на минимальную питательную среду.

На этой среде без метионина, биотина, треонина и лейцина появились прототрофные колонии Met⁺, Bio⁺, Thr⁺, Leu⁺. Опытным путем ученые установили, что ни трансформации, ни трансдукции в данном случае не наблюдалось. Был сделан вывод о происхождении рекомбинантных геномов в результате непосредственного контакта родительских клеток. Микрофотографии конъюгирующих клеток явились доказательством того, что между ними образуется цитоплазматический мостик.

В 1952 году Хейтс выяснил, что при конъюгации одна клетка является мужским донором, а другая – женским реципиентом. Клетки-доноры обладают половым фактором F (от fertility – плодовитость), который представляет собой замкнутую в кольцо молекулу ДНК. Перенос генетического материала происходит в одном направлении – от донорской (мужской F⁺) клетки к реципиентной (женской F^-).

Необходимым условием конъюгации является наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды, продуцирующей половые пили, образующие трубочку, по которой плазмидная ДНК передается из клетки-донора в клетку-реципиент, в результате чего последняя приобретает донорские свойства. В случае, когда F-фактор встраивается в хромосому донора и функционирует в виде единого с ней репликона, то нуклеоид донора приобретает способность передаваться в клетку-реципиент. Донорские клетки, содержащие встроенный в нуклеоид F-фактор, называются Hfr-клетками (от английского high frequency of recombination – высокая частота рекомбинаций).

Процессы генетической рекомбинации у бактерий (трансформация, трансдукция, конъюгация) различны по форме, но аналогичны по содержанию, т. к. в результате каждого процесса происходит перенос фрагмента ДНК от одной клетки к другой. При трансформации бактерии-реципиенту передается свободная ДНК, при трансдукции перенос участка ДНК осуществляется при помощи бактериофага, а при конъюгации транспортировка участка ДНК происходит через цитоплазматический мостик между бактериями.

9. Генетические рекомбинации у бактерий

Заключительным этапом при любой форме обмена генетическим материалом является рекомбинация между привнесенной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. Если переносится одна нить ДНК, то она вначале достраивается комплементарной ей нитью; рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Различают общую рекомбинацию, сайт-специфическую рекомбинацию и рекомбинацию, контролируемую транспонируемыми элементами.

Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация происходит за счет наличия специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК. Ее примером является специфическая рекомбинация между умеренным фагом X и хромосомой Е. coli. Как в бактериальной хромосоме, так и в ДНК фага X имеются специфические участки (attB и attP соответственно), между которыми и происходит сайт-специфическая рекомбинация. Общая и сайт-специфическая рекомбинация контролируется геном гесА.

Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, тоже являются сайт-специфическими, но специфичность этих сайтов связана с особыми нуклеотидными последовательностями, и эта форма рекомбинации не зависит от гесА-гена.

Главным генетическим детерминантом всех путей рекомбинации является ген гесА. Его повреждение полностью исключает возможность образования рекомбинантов. Основной способ recA-рекомбинации осуществляется с участием продуктов генов гесВ и гесС (они кодируют синтез эндонуклеазы V). Таким образом, генетический контроль рекомбинаций носит сложный характер.

Изучение его механизма — одна из центральных задач молекулярной генетики. Особый интерес представляет изучение механизма гомологической рекомбинации. Это определяется перспективами развития молекулярной медицины. Одной из важнейших стратегических задач, поставленных перед программой «Геном человека», является обнаружение изменений первичной структуры ДНК, которые приводят к нарушению функции генов и, как следствие этого, к развитию наследственных заболеваний человека.

Идеальным методом лечения их является генотерапия, основанная на замене поврежденного («больного») гена здоровым. Такая замена может быть осуществлена только с помощью гомологической рекомбинации, механизмы которой у бактерий и эукариот, очевидно, во многом сходны. У бактерий выявлены два способа такой рекомбинации, осуществляемых двумя типами рекомбиназ: АТФ-зависимым белком RecA и АТФ-независимой ренатуразой. Соответственно, и у эукариот обнаружены АТФ-зависимые и АТФ-независимые ДНК-трансферазы, среди которых найдены белки, функционально сходные с RecA-белком бактерий.

10. Споры и спорообразование прокариот

Образование эндоспор - процесс, имеющий место только в мире прокариот. Бактериальные эндоспоры - это особый тип покоящихся клеток грамположительных эубактерий, формирующихся эндогенно, т.е. внутри цитоплазмы "материнской" клетки (спорангия), обладающих специфическими структурами (многослойными белковыми покровами, наружной и внутренней мембранами, кортексом) и устойчивостью к высоким температурам и дозам радиации, летальным в норме для вегетативных клеток (рис. 22, Г). Эндоспорам свойственно также и особое физическое состояние протопласта.

К спорообразующим относится большое число эубактерий приблизительно из 15 родов, характеризующихся морфологическим и физиологическим разнообразием (табл. 7). Среди них имеются палочковидные, сферические, мицелиальные формы, спириллы и нитчатые организмы. Все они имеют строение клеточной стенки, характерное для таковой грамположительных эубактерий. Ни в одном случае не выявлена наружная липополисахаридная мембрана, несмотря на то, что многие роды и виды спорообразующих бактерий не окрашиваются по Граму. По типу питания среди них обнаруженыхемоорганогетеротрофы, факультативные хемолитоавтотрофы и паразитические формы.

Отношение к кислороду также разнообразно: часть спорообразующих форм представлена аэробами и факультативными анаэробами, другая часть включает облигатных анаэробов - от аэротолерантных форм до высокочувствительных к О2.

Лучше всего процесс спорообразования изучен у представителей родов Bacillus и Clostridium, хотя имеющиеся данные позволяют сделать вывод о принципиальной однотипности этого процесса у всех видов, образующих эндоспоры. В каждой бактериальной клетке, как правило, формируется одна эндоспора. (Описана анаэробная бактерия, образующая в клетке до 3-5 эндоспор).

Первым шагом к спорообразованию является изменение морфологии ядерного вещества вегетативной клетки, образующего тяж вдоль длинной оси спорулирующей клетки (рис. 23). Приблизительно одна треть тяжа затем отделяется и переходит в формирующуюся спору. У некоторых видов ядерный тяж образуется только на одном полюсе клетки, в его формировании участвует не весь генетический материал вегетативной клетки, и впоследствии ядерный тяж целиком переходит в формирующуюся спору. Биологический смысл формирования ядерного тяжа до сих пор остается невыясненным.

Формирование споры начинается с того, что у одного из полюсов клетки происходит уплотнениецитоплазмы, которая вместе с генетическим материалом, представляющим собой одну или несколько полностью реплицированных хромосом, обособляется от остального клеточного содержимого с помощью перегородки. Последняя формируется впячиванием внутрь клетки ЦПМ. Мембрана нарастает от периферии к центру, где срастается, что приводит к образованию споровой перегородки. Эта стадия формирования споры напоминает клеточное деление путем образования поперечной перегородки (см.рис. 20, А). Следующий этап формирования споры - "обрастание" отсеченного участка клеточной цитоплазмы с ядерным материалом мембраной вегетативной клетки, конечным результатом которого является образование проспоры - структуры, расположенной внутри материнской клетки и полностью отделенной от нее двумя элементарными мембранами: наружной и внутренней по отношению к проспоре.

Описанные выше этапы формирования споры (вплоть до образования проспоры) обратимы. Оказалось, что если к спорулирующей культуре добавить антибиотик хлорамфеникол (ингибитор белкового синтеза и, следовательно, ингибитор синтеза мембранных белков), то можно остановить "обрастание" клеточной мембраной отсеченного септой участка цитоплазмы, и процесс спорообразования превратится в процесс клеточного деления. (Между двумя мембранами септы откладывается материал клеточной стенки.) После образования проспоры дальнейшие этапы спорообразования уже необратимы.

Между наружным и внутренним мембранными слоями проспоры начинается формированиекортикального слоя (кортекса). Затем поверх наружной мембраны проспоры синтезируются споровые покровы, состоящие из нескольких слоев, число, толщина и строение которых различны у разных видов спорообразующих бактерий. В формировании слоев споровых покровов принимает участие как наружная мембрана споры, так и протопласт материнской клетки.

У многих бактерий поверх покровов споры формируется еще одна структура - экзоспориум, строение которого различно в зависимости от вида бактерий. Часто экзоспориум многослойный, с характерной для каждого слоя тонкой структурой.

Все слои, окружающие протопласт эндоспоры, находятся внутри материнской клетки. На их долю приходится примерно половина сухого вещества споры.

После сформирования споры происходит разрушение (лизис) "материнской" клеточной стенки и спора выходит в среду.

Спорообразование сопровождается активным синтезом белка. Белки эндоспор в отличие от белков вегетативных клеток богаты цистеином и гидрофобными аминокислотами, с чем связывают устойчивость спор к действию неблагоприятных факторов. Содержание ДНК в споре несколько ниже, чем в исходной вегетативной клетке, поскольку в спору переходит лишь часть генетического материала материнской клетки. Генетический материал поступает в спору в виде полностью реплицированных молекул ДНК. Споры некоторых видов содержат по 2 или 3 копии хромосомы. Содержание РНК в спорах ниже, чем в вегетативных клетках, и РНК в значительной степени при спорообразовании синтезируется заново.

Одним из характерных процессов, сопровождающих образование эндоспор, является накопление в нихдипиколиновой кислоты и ионов кальция в эквимолярных количествах. Эти соединения образуют комплекс, локализованный в сердцевине споры. Помимо Са2+ в эндоспорах обнаружено повышенное содержание других катионов (Mg2+, Mn2+, К+), с которыми связывают пребывание спор в состоянии покоя и их термоустойчивость.

Существенные отличия эндоспор от вегетативных клеток выявляются при изучении химического состава отдельных споровых структур. Экзоспориум состоит из липидов и белков и, вероятно, выполняет функцию дополнительного барьера, защищающего спору от внешних воздействий, а также регулирующего проникновение в нее различных веществ. Однако никаких данных, подтверждающих эти предположения, пока нет. Механическое удаление экзоспориума не приводит к какому-либо повреждению спор. Они обнаруживают такую же способность к прорастанию, как и споры с неудаленным экзоспориумом.

Споровые покровы в основном состоят из белков и в небольшом количестве из липидов и гликолипидов. Белки покровов обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям и обеспечивают спорам защиту от действия литических ферментов, других повреждающих факторов, а также предохраняют спору от преждевременного прорастания. Оказалось, что споры мутантов, лишенные покровов, прорастают сразу же после выхода из материнской клетки, даже если условия для последующего роста неблагоприятны.

Кортекс построен в основном из молекул особого типа пептидогликана. При прорастании споры из части кортекса, прилегающей к внутренней споровой мембране, формируется клеточная стенка вегетативной клетки.

В отличие от эндоспор, образующихся внутри материнской клетки и окруженных двумя элементарными мембранами, экзоспоры бактерий из рода Methylosinus и Rhodomicrobium формируются в результате отпочкования от одного из полюсов материнской клетки. Образование экзоспор сопровождается уплотнением и утолщением клеточной стенки. У экзоспор отсутствуют дипиколиновая кислота и характерные для эндоспор структуры (кортекс, экзоспориум).

К другим покоящимся формам бактерий относятся цисты, экзоспоры,

миксоспоры. Как и эндоспоры, все эти покоящиеся формы предназначе-

ны для перенесения бактериями неблагоприятных условий. Э кзоспоры