АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы определения количества бактерий

Приготовление разведений

Приготовление десятикратных разведений исследуемого материала - одна из наиболее

частых процедур в технике санитарно-микробиологических исследований. Несмотря на

кажущуюся техническую простоту, она является одной из наиболее существенных источников

ошибок при определении количества микроорганизмов в объекте. Поэтому при приготовлении

разведении недопустимы малейшие отклонения от регламентированных процедур.

В стерильные пробирки с соблюдением правил асептики разливают стерильную воду или

специальный раствор для разведений по 9 см3

. Стерилизация заранее мерно расфасованной

жидкости для разведений не желательна, так как при автоклавировании ее объем может

измениться из-за испарения. Для приготовления 1-го разведения (1/10) 1 мл анализируемой пробы

стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 см3

жидкости для разведения. При этом пипетку

нельзя погружать в воду более чем на 3 мм, во избежание смывания микроорганизмов с ее

наружной поверхности. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое

пробирки путем многократного заполнения и опорожнения пипетки, набирают 1 мл разведения

1/10 и переносят в следующую пробирку с 9 см3

жидкости для разведения, получая при этом

разведение 1/100. Повторяют эти операции до получения всего необходимого набора разведений.

Глубинный посев в плотные питательные среды

Метод используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в тех

случаях, когда их идентификация не требуется, либо когда селекция нужной физиологической

группы бактерий может быть осуществлена за счет температуры инкубации, состава питательной

среды или обработки исследуемого материала перед посевом.

Питательный агар расплавляют и охлаждают до 45±5°С. На столе раскладывают пустые

стерильные чашки Петри и делают на их крышках необходимые надписи. После перемешивания

образца в чашку с соблюдением правил асептики стерильной пипеткой, вносят 1 мл исходного

материала или заранее приготовленного разведения. Разведения выбирают с таким расчетом,

чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. При исследовании пищевых продуктов общее

количество колоний может колебаться в пределах 15-30. Из каждой пробы засевают как минимум

2 разведения или, если разведения не производили, проводится посев на 2 чашки по 1 мл

исходного материала. В некоторых случаях, например, при исследовании пищевых продуктов,

каждое разведение засевают на 2 параллельные чашки. После внесения материала (разведения) в

чашку заливают 10-12 мл питательного агара, предварительно профламбировав горлышко сосуда.

Слой питательной среды должен быть толщиной 4-5 мм. Затем быстро перемешивают содержимое

чашки, передвигая ее круговыми движениями по поверхности стола. Следует избегать

образования пузырьков, смачивания стенок и крышки. Рекомендуется, чтобы время от внесения

материала до заливки питательной средой не превышало 15 минут.

После застывания питательной среды чашки переворачивают и стопками, не более чем по 3-

4, помещают в термостат. Посевы инкубируют при заданной температуре в течение определенного

времени. Для дальнейшей работы выбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, а

при посеве нативного материала - от 0 до 300 колоний.

Количество колоний на поверхности и в глубине агара подсчитывают невооруженным

глазом или используя лупу с увеличением в 2-5 раз. Для этого чашку помещают вверх дном на

поверхность черного цвета или применяют специальный прибор для счета бактерий (например.

ПСБ).

Если даже на чашке с посевом максимального разведения выросло более 300 колоний, а

анализ, увеличив разведение, повторить нельзя, то допускается подсчет колоний с помощью

пластинки с лупой и сетки при сильном боковом освещении. Сетку изготавливают из

органического стекла, на котором прочерчивают линии таким образом, чтобы образовалась сетка

из квадратов со стороной 1 см. Подсчитывают количество колоний не менее чем в 20 квадратах,

затем рассчитывают среднее число колоний на 1 см2

и умножают на площадь питательной среды в

чашке. Результат выражают как количество бактерий в 1 см' (г) исходного материала, для чего

умножают количество выросших колоний на засеянный с учетом разведения объем пробы. За

окончательный результат принимают среднее арифметическое подсчета по 2 параллельным

чашкам или 2 соседним разведениям. Допускается учет по 1 чашке, если при посеве большего

разведения выросло менее 20 колоний или на второй чашке имеет место ползучий рост,

затрудняющий точное определение количества колоний. Рассчитанный результат может быть

округлен в соответствии с требованиями нормативных документов.

Метод широко используют при исследовании различных объектов окружающей среды и в

различных модификациях.

Поверхностный посев на плотные питательные среды

Посев шпателем

Метод используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в тех

случаях, когда после подсчета колоний может возникнуть необходимость в выделении чистой

культуры и ее идентификации. Он менее точен, по сравнению с методом посева в глубину плотной

среды, так как часть микроорганизмов может быть адсорбирована шпателем.

Питательную среду разливают в чашки Петри и. после застывания, подсушивают. Для этого

чашки переворачивают вверх дном, открывают и выдерживают в термостате 30 минут при 48-50

°С или в ламинарном боксе 1-2 часа. На подсушенную питательную среду наносят заданное

количество исследуемого материала или его разведения (как правило. 0,01-0.1 мл) и немедленно

равномерно распределяют по поверхности стеклянным шпателем. Перед помещением в термостат

чашки выдерживают на столе в горизонтальном положении 15 минут. После инкубации посевов

проводят подсчет колоний, при этом возможен учет колоний только с заданными культуральными

свойствами, а при использовании дифференциальных сред - с заданными биохимическими

характеристиками.

Разведения исследуемого материала следует выбирать таким образом, чтобы количество

колоний на чашке составляло 15-300, количество колоний специфических групп (например,

БГКП) -15-150; количество колоний плесеней - 5-50. Обработка результатов не имеет

принципиальных отличий от таковой при использовании метода глубинного посева в плотную

питательною среду. При необходимости подтверждения принадлежности микроорганизмов к

определенной группе отбирают не менее 5 колоний, которые откалывают (пересевают) на

питательные среды для выделения чистой культуры. Настоящий метод используется, например,

при исследовании некоторых видов пищевых продуктов.

Капельный метод

Метод используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в

полевых условиях, а также в научно-исследовательской работе. Так как исследуемый материал

или его разведения засевают на поверхность питательной среды в виде капель определенного

объема, а количество колоний, выросших из каждой капли, учитывается отдельно, удается более

экономно расходовать питательные среды и лабораторную посуду за счет посева на одну чашку

нескольких проб. В то же время, если хотя бы в одной капле будут присутствовать

микроорганизмы, способные к подвижному росту, учесть результат будет невозможно.

Чашки с питательным агаром тщательно подсушивают (см. посев шпателем). Одна чашка

может быть использована для посева до 8 разных проб или разведений. Место, куда будет

нанесена каждая из них. маркируют на обратной стороне донышка чашки.

На поверхность питательного агара с помощью микропипетки или пипеточного дозатора

наносят капли исследуемого материала либо его разведении объемом 0,01 или 0,02 мл. Капли не

должны сливаться между собой. Чашки выдерживают на столе до полного высыхания капель,

переворачивают и помещают в термостат. Подсчет колоний проводят в каждой капле отдельно.

При выборе разведении следует стремиться к тому, чтобы количество колоний в капле не

превышало 50. Проводят расчет количества микроорганизмов в единице объема (массы)

исследуемого материала с учетом разведения и объема засеянной капли (0,01 или 0,02 мл).

Метод используется, например, при исследовании питьевой воды в полевых условиях.

Метод мембранных фильтров

Метод предназначен для определения небольших количеств жизнеспособных

микроорганизмов в жидких средах. Широко применяется для определения индексов санитарно-

показательных микроорганизмов, а также при исследовании жидкостей, обладающих

антимикробным действием. Для определения количества бактерий используют фильтры с диаметром пор не более 0,3

мкм, например, мембранные фильтры №2, 3 или фильтрующие мембраны "Владипор" МФА-МА

№5, 6, 7, 8. Отобранные для работы фильтры визуально проверяют па отсутствие трещин,

изломов, деформаций, а затем подвергают специальной обработке и стерилизации.

Мембранные фильтры из нитроцеллюлозы по одному помещают на поверхность нагретой до

80°С дистиллированной воды и медленно доводят до кипения на слабом огне. Затем воду

заменяют и кипятят еще 10 мин. Смену воды необходимо повторить 3-5 раз для полного удаления

остатков растворителя из фильтра. Отмытые фильтры можно хранить в дистиллированной воде

или в сухом виде. Непосредственно перед работой их повторно обрабатывают кипячением.

Мембраны "Владипор" также обрабатывают кипячением. Во избежание деформации

мембран на дно сосуда помещают нержавеющую сетку или "сторож для молока", чтобы не

допустить бурного кипения. Мембраны опускают в воду, нагретую до 80-90° С, и кипятят на

слабом огне 10-15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим объемом стерильной

дистиллированной воды.

Другие виды фильтров готовят к исследованию согласно инструкции предприятия-

изготовителя.

Для фильтрации используют специальные фильтрационные установки: аппарат Зейтца,

прибор Гробара, аппарат Рублевской водопроводной станции и др. Установка состоит из патрона

для фильтра, емкости, в которую помещают исследуемый материал, приемного сосуда для

фильтрата и вакуумного насоса.

Перед работой патрон для фильтра и емкость для исследуемого материала стерилизуют

фламбированием после обтирания смоченным спиртом тампоном или другим подходящим

способом, либо кипятят. После охлаждения на сетку патрона с помощью фламбированного

пинцета помещают фильтр и прижимают его емкостью для исследуемого материала

В емкость для исследуемого материала при соблюдении правил стерильности наливают

необходимый объем пробы и создают вакуум в приемном сосуде. Объем фильтруемой жидкости

указан в НТД, регламентирующей исследование данного объекта. При отсутствии

соответствующих указаний следует выбирать такой объем жидкости, чтобы на фильтре выросло

не более 30 колоний искомой группы микроорганизмов.

Сразу после завершения фильтрации насос выключают, разбирают установку и

фламбированным пинцетом осторожно извлекают фильтр. Фильтр тем же пинцетом, не

переворачивая, помещают на питательную среду, поверхностью с осевшими на ней бактериями

вверх. При этом необходимо избегать образования пузырьков воздуха между средой и фильтром.

Па одну стандартную чашку можно поместить до 4 фильтров при условии, что они не будут

соприкасаться между собой.

Если исследуемый материал содержит большое количество взвешенных веществ,

фильтрацию проводят в 2 этапа: сначала через предварительный фильтр с размером пор 4 мкм

(можно использовать мембранный фильтр № 6 или мембрану МФА-МА № 10), а затем через

основной фильтр со средним диаметром пор не более 0,3 мкм. Для этого при сборке установки

предварительный фильтр укладывают поверх основного. По окончании фильтрации оба фильтра

переносят на питательную среду и в дальнейшем учитывают суммарное количество колоний,

выросших на двух фильтрах.

После фильтрации растворов с высоким осмотическим давлением или растворов веществ,

обладающих антимикробной активностью, фильтр необходимо промыть стерильной

дистиллированной водой или водно-солевым раствором.

Питательные среды с помещенными на их поверхность фильтрами, инкубируют в

благоприятных для выделения искомых микроорганизмов условиях. В последующем проводят

подсчет колоний с заданными свойствами, при необходимости - выделение чистой культуры и ее

идентификацию, а затем, с учетом профильтрованного объема, рассчитывают количество

бактерий в единице объема исследованной жидкости.

Мембранная фильтрация применяется в санитарной микробиологии очень широко. Она

может быть использована не только для определения концентрации микроорганизмов, но и для

контроля стерильности больших объемов жидкости.

Метод посева в жидкие среды (бродильный, титрационный метод)

Метод используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в

жидких средах, широко применяется для определения индексов санитарно-показательных

микроорганизмов В начале готовят ряд разведении исследуемого материала, при этом шаг разведений в

принципе может быть любым, но в санитарной микробиологии чаще используют десятикратные

разведения. Затем проводят посев в жидкие питательные среды, при этом каждое разведение

можно высевать в I пробирку с жидкой средой - однорядный метод, в 2 - двухрядный метод, в 3 -

трехрядный и т. д. С увеличением количества рядов возрастает точность определения, однако, так

как увеличение числа рядов более 10 не ведет к существенному увеличению точности, их число

даже в научных исследованиях, как правило, не превышает 10. Для практических целей в

санитарной микробиологии чаще всего используют трехрядный метод. В каждую пробирку

засевают 1 мл разведения или кратный 10 (1, 10, 100 мл) объем исследуемого материала и после

инкубации учитывают количество пробирок с признаками роста микроорганизмов в каждом

разведении. При необходимости делают высев на плотную питательную среду и подтверждают

принадлежность бактерий к заданной группе или виду.

Для последующих расчетов выбирают три самые высокие последовательные разведения, в

которых встречаются как пробирки с ростом искомых микроорганизмов, так и без него. При этом

желательно, чтобы в наибольшем разведении тройки или в следующем за избранной тройкой

разведении рост микроорганизмов отсутствовал. Из числа положительных пробирок в каждом из

входящих в тройку разведении составляют формулу, согласно которой находят НВЧ (наиболее

вероятное число) по специальным таблицам

Посев микроорганизмов из воздуха. Наиболее простым способом определения общего количества микроорганизмов в воздухе является метод оседания микробов на агаровую пластинку, предложенный Р. Кохом. Метод заключается в том, что чашку Петри с мясопептонным агаром открывают в исследуемом помещении на 5 мин, после чего закрывают крышкой, оборачивают бумагой, переворачивают вверх дном во избежание размыва колоний конденсационной водой, подписывают и помещают в термостат при 28-30 ºС для выращивания микробов, которые оседают на питательную среду вместе с пылью. По количеству выросших колоний можно судить о степени загрязненности воздуха микроорганизмами.

Количественный учёт микроорганизмов в воздухе. Р.Кох экспериментально установил, что за 5 мин на поверхность 100 см² оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л, или 0,01 м³ воздуха.

Рассчитывают, сколько микробов содержится в 1 м³ воздуха над открытой при посеве чашкой Петри с МПА.

Для этого:

1. Через 5-7 дней после посева подсчитывают число выросших в чашке колоний (n). Колония – это потомство одной микробной клетки на питательной среде.

2. Узнают площадь чашки Петри, для чего измеряют диаметр внутренней чашки со средой (5 см²) и рассчитывают по формуле:

S чашки Петри = π r² = 3,14´ 5² = 78,5 см².

3. Определяют число микроорганизмов в 1 м³ воздуха. Зная, сколько микробов выросло на площади 78,5 см², можно пересчитать, сколько их было бы на 100 см², а это, по методике Коха, соответствует их содержанию в 0,01 м³, значит в 1 м³ их должно быть в 100 раз больше. Рассчитывают число микроорганизмов в 1 м³ воздуха (x) по формуле:

Воздух считается загрязнённым, если в 1 м³ более 4,5 тыс. микроорганизмов.

Делают вывод о количестве микробов в помещении, где проводился анализ микрофлоры воздуха.

Определение качественного состава микрофлоры воздуха. Под качественным анализом микрофлоры понимается описание культуральных и морфологических признаков микроорганизмов, что служит основой для определения их видовой принадлежности.

Культуральные признаки – это внешний вид колоний при выращивании на различных питательных средах. К культуральным признакам колонии относятся:

1) размер – крупные (диаметр 4-6 мм и более), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и точечные (не более 1 мм) колонии;

2) форма – круглая, овальная, неправильная, амёбовидная, ветвистая, ризоидная и др.;

3) цвет – белый, розовый, жёлтый, оранжевый, красный и др.;

4) профиль или рельеф – плоский, выпуклый, кратеровидный, конусовидный, изогнутый и др.;

5) поверхность – блестящая, матовая, морщинистая, гладкая и др.;

6) консистенция – жидкая, вязкая, пастообразная, сухая, плотная и др. (устанавливается прикосновением к поверхности колонии бактериологической петлей);

7) край – ровный, волнистый, лопастной, бахромчатый и др. (рассматривают, пользуясь лупой или под микроскопом).

К морфологическим признакам микробов относятся форма, характер деления и размер клеток, особенности спорообразования и жгутикования, наличие капсулы, включений, окраска по Граму и др.

Для описания морфологических признаков из доминирующих колоний готовят препараты-мазки – петлей берут немного микробного материала и тщательно размазывают по стеклу, фиксируют в пламени, окрашивают кристаллвиолетом 30-60 с и рассматривают, пользуясь иммерсионной системой микроскопа. Отмечают форму клеток, наличие или отсутствие спор, капсул и зарисовывают в тетради. Делают выводы о преобладающих формах микроорганизмов в воздухе.

24. Микроскопические методы исследования микроорганизмов

Микроорганизмы и вирусы очень малые по своим размерам, так что увидеть их невооруженным глазом невозможно. В то же время морфология микробов, их размеры, форма, взаимное расположение клеток, наличие или отсутствие жгутиков, внутренняя ультраструктура является очень важной их характеристикой и часто служит основой классификации. Ввиду этого, одним из важнейших методов исследования строения микроорганизмов является микроскопия. В основе современных микроскопических методов исследования лежит световая микроскопия с многочисленными ее разновидностями, такими как темнопольная, фазовоконтрастная, аноптральная, поляризационная, интерференционная, люминесцентная и др. При изучении анатомии и ультраструктуры вирусов используют электронную микроскопию.

Современная промышленность выпускает много видов микроскопов в зависимости от их назначения. В практической работе рутинных баклабораторий чаще всего пользуются микроскопами МБР-1, МБР-3.

Микроскоп состоит из механической, оптической и осветительной частей. К механической относят штатив, тубус, револьвер, предметный столик, макро- и микровинт, к оптической  объективы и окуляры, к осветительной зеркало и конденсор.

В верхней части штатива есть тубус, в который вставляется окуляр, а снизу он имеет револьвер, в отверстия которого вставлено 3-4 обьектива. Вращая револьвер, можно установить любой обьектив под отверстие тубуса. Последний поднимается и опускается с помощью макро- и микрометрического винтов. Для грубого наведения изображения пользуются макровинтом. Более точно это делается с помощью микровинта. Микрометрический винт является одной из наиболее хрупких частей микроскопа и требует осторожного обращения с ним.

Предметный столик имеет круглую или прямоугольную форму. В его центре находится отверстие, над которым помещают предметное стекло с препаратом (мазком). В более совершенных микроскопах есть очень удобные предметные столики, которые с помощью специальных устройств перемещают предметное стекло в двух взаимо перпендикулярных направлениях.

Самой ценной частью микроскопа являются обьективы, которые состоят из нескольких линз в общей металлической оправе. Обьективы разделяются на сухие (х8, х40) и имерсионные (х90 х120). Сухими называют такие обьективы, между фронтальной линзой которых и предметным стеклом находится воздух. При этом, в связи с разницей показателей преломления стекла и воздуха (соответственно 1,52 и 1,0), часть световых лучей не попадает в глаз исследоавтеля. Имерсионными называют такие обьективы, между фронтальной линзой которых и исследуемым обьектом находится кедровое, персиковое масло или "имерсиол", коэффициент преломления света которых такой же, как и у стекла. При исследовании морфологии микроорганизмов пользуются преимущественно имерсионными обьективами, которые часто называют имерсионной системой.

Важнейшей характеристикой любого обьектива является его разрешающая способность. Это наименьшее расстояние между двумя точками, при которой они еще видимы раздельно, то есть не сливаются в одну. Разрешающая способность обьектива ограничена такими явлениями, как хроматическая и сферическая аберрации, дифракция и др. Если оба вида аберрации можно устранить, то явление дифракции существует в любой оптической системе и его устранить или, хотя бы, уменьшить практически невозможно. Дифракция в значительной степени ограничивает разрешающую способность микроскопов.

Следовательно, при пользовании даже наилучшими имерсионными обьективами невозможно увидеть обьекты, которые имеют размеры меньше 0,2 мкм. Полезное увеличение обьектива не может превышать нумерическюу апертуру больше, чем в 1000 раз. Таким образом, максимальное полезное увеличение современных микроскопов при использовании имерсионных обьективов с апертурой 1,40-1,60 достигает 1400-1600.

Окуляр состоит из двух линз и только увеличивает изображение, которое выходит из обьектива, не добавляя к нему никаких деталей. Существуют окуляры с такими увеличениями: х7, х10, х15. Эти цифры обозначены на них.

Осветительный аппарат находится под предметным столиком и состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой. Зеркало направляет пучок света в конденсор, а через него  в обьектив микроскопа. Одна сторона зеркала вогнутая, вторая плоская. При микроскопировании с конденсором необходимо пользоваться лишь плоским зеркалом. Конденсор Аббеа состоит из системы линз для сбора пучка лучей в одной точке (фокус), которая находится в плоскости исследуемого препарата. При работе с дневным освещением конденсор нужно поднимать к уровню предметного столика, с искусственным опускать до тех пор, пока изображение источника света не появится в плоскости, препарата. При исследовании неокрашенных препаратов конденсор также опускают.

Обьем света в соответствии с потребностями исследования регулируется диафрагмой, которая находится под конденсором. Она может сужаться и расширяться подобно зенице глаза (отсюда название ирис-диафрагма). Окрашенные препараты рассматривают при открытой, а неокрашенные  при суженой диафрагме.

Современные микроскопы имеют ряд усовершенствований, благодаря которым улучшается изображение и расширяются границы видимости. Первое достигнуто выпуском микроскопов-бинокуляров, второе исследованием в темном поле зрения. Бинокулярный микроскоп имеет специальную насадку с двумя тубусами (бинокулярная насадка). Это создает ряд преимуществ при микроскопировании. Исследуемый препарат рассматривают сразу обоими глазами, что не вызывает переутомления органа зрения. При этом одновременно достигается большая четкость глубины изображение и его пластичность.

С целью фундаментальных исследований морфологии микроорганизмов и других клеток оптическая промышленность выпускает более совершенные микроскопы. Одним из них является микроскоп универсальный биологический исследовательский МБД-15. С его помощью можно проводить широкий обєм микроскопических исследований: визуальное наблюдение, использования светлого и темного полей зрения в прямом, косом и отраженном свете, метода фазовых контрастов, люминесцентной и интерференционной микроскопии. Для микрофотографирования исследуемых обьектов микроскоп оснащен фотоаппаратом с автоматическим затвором, фотоэкспонометром и импульсной лампой.

При изучении динамики развития и размножения микроорганизмов, действия на них разных физических и химических факторов, образования L-форм и других проблем изготовляют специальные микроскопы с микроустановками для цейтраферной (прерывистой) микрокиносъемки особенно с использованием метода фазовых контрастов.

Правила работы с имерсионной системой:

1. Поднять конденсор Аббеа к уровню предметного столика, полностью открыть ирис-диафрагму.

2. Пользуясь обьективом 8, с помощью плоского зеркала добиться максимального освещения поля зрения.

3. На предметном столике разместить окрашенный мазок препарата, нанести на него кедровое масло и закрепить клеммами.

4. Возвращая револьвер, установить над препаратом имерсионный обьектив 90, под контролем зрения опустить его в каплю кедрового масла.

5. Глядя в окуляр левым глазом (не закрывая правого), сначала с помощью макровинта найти контуры изображения, потом, пользуясь микровинтом, достичь максимальной четкости, ичить и зарисовать препарат.

6. По окончании работы поднять тубус, снять предметное стекло, осторожно вытереть имерсионный обьектив от кедрового масла, повернуть его в сторону, опустить тубус.

Темнопольная микроскопия отличается от обычной имерсионной световой способом освещения препарата. В обычном микроскопе обьект исследуют при свете, который проходит, в темнопольном  при боковом освещении. Для микроскопии в темном поле используют вместо конденсора Аббе специальный конденсор (кардиоид-конденсор) параболоида, в котором боковая поверхность зеркальная, а центральная часть нижней линзы затемнена, в результате чего образуется темное поле зрения. Яркие боковые лучи, отражаясь от зеркальной поверхности, фокусируются в плоскости обьекта, но в глаза микроскописта не попадают. В обьектив проникают лишь те лучи, которые оттражаются частичками препарата благодаря преломлению или дифракции. Следовательно, на темном поле зрения микробные клетки и другие мелкие частицы выглядят очень яркими. Картина напоминает мигающие звезды на темном небе.

Темнопольный микроскоп дает возможность рассматривать обьекты размером 0,02-0,04 мкм, то есть значительно меньше, чем под обычным световым микроскопом. Потому темнопольный микроскоп часто называют ультрамикроскопом. Микроскопию в темном поле зрения используют для исследования подвижности бактерий, выявления возбудителей сифилиса, лептоспироза, возвратного тифа. Но при этом нельзя хорошо изучить внутреннюю структуру микроорганизмов. Для этой цели предложенны видоизмененные методы оптической микроскопии: фазово-контрастная, аноптральна и люминесцентная.

Фазовоконтрастна микроскопия  способ микроскопического исследования прозрачных, не поглощающих света обьектов, который базируется на усилении контраста изображения. Он заключается в том, что живые клетки (бактерии), слабо поглощая свет, все же способны изменять фазу проникающих лучей. В разных участках клетки толщина, плотность, а, следовательно, и показатели преломления света будут неодинаковы. Эту разницу в фазах ни орган зрения, ни фотопленка не замечают. Но их можно сделать видимыми с помощью специального фазовоконтрастного устройства. Он включает у себя конденсор с набором кольцевых диафрагм, которые обеспечивают освещение препарата полным конусом света, и фазовоконтрастные обьективы. Они отличаются от обычных обьективов тем, что в их главном фокусе располагается полупрозрачная фазовая пластинка в виде кольца. Именно она вызывает сдвиг фазы света, который проходит через нее. Это позволяет сделать неокрашенные препараты четко видимыми.

При работе из фазовоконтрастным микроскопом клетки могут выглядеть темными (позитивный фазовый контраст) или светлыми (негативный контраст) в сравнении с окружающим фоном. Этот вид микроскопии не увеличивает разрешающей способности, но позволяет обнаружить новые детали внутренней структуры живых бактерий, стадии их развития, изменения под воздействием антибиотиков и других химиопрепаратов. Он имеет и некоторые недостатки: слабая контрастность изображений, наличие сияющих ореолов вокруг исследуемых обєктів. Значительные преимущества перед фазовоконтрастним микроскопом имеет аноптральний микроскоп.

Люминесцентная микроскопия в последнее время широко используется в микробиологических исследованиях. Этот метод позволяет наблюдать первичную или вторичную люминесценцию (свечение) микроорганизмов, клеток, тканей и отдельных их структур. Изображение в люминесцентном микроскопе возникает из-за свечения самого препарата, которое возникает при освещении его коротковолновой частью спектра. Метод основан на использовании явления флуоресценции. Так как большинство болезнетворных микробов не имеют первичной (собственной) люминесценции, их сначала обрабатывают слабыми растворами специальных красителей (флуорохромов), которые связываются определенными структурами живых бактерий, не нанося им вреда. Чаще всего применяют такие флуорохромы: акридиновый оранжевый, аурамин, корифосфин, изотиоцианат флуоресцеина, трипафлавин и др.

Лучи света от сильного источника, например, ртутной лампы избыточного давления, пропускают через сине-фиолетовый светофильтр. Под действием такого облучения окрашенные флуорохромом бактерии начинают светиться красным, зеленым, желтым или другим цветом. Так, при окраске дифтерийных палочек корифосфином они приобретают желто-зеленое свечение, а при обработке аурамин-родамином возбудитель туберкулеза светится золотисто-оранжевым цветом.

Метод люминесцентной микроскопии намного более чувствительный сравнительно с другими микроскопическими исследованиями. Он позволяет обнаружить такое малое количество возбудителя, которое другими методами не находят. По характеру люминесценции можно дифференцировать отдельные химические вещества, которые входят в состав микробных клеток. Использование люминесцентного микроскопа имеет ряд преимуществ: цветное изображение, высокая контрастность, возможность исследовать как живые, так и убитые микроорганизмы.

Люминесцентную микроскопию широко применяют для выявления антигенов и антител (метод иммунофлуоресценции). С ее помощью можно увидеть микробы, которые содержат определенные антигены. Для их выявления необходимо иметь специфические люминесцентные сыворотки, которые вызывают флуоресценцию именно данного антигена. Этот метод успешно используют для экспресс-диагностики многих бактериальных и вирусных заболеваний.

Электронная микроскопия. Для изучения строения микроорганизмов на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для исследования структуры и архитектоники вирусов используют электронный микроскоп. Это высоковольтный вакуумный прибор, в котором увеличенное изображение получают с помощью потока электронов. Он обладает высокой разрешающей способностью и может давать увеличение от 20 тыс. до 5 млн. раз. По принципу действия различают трансмиссионные, сканирующие (растровые) и комбинированные электронные микроскопы.

Принципиальная схема трансмиссионного электронного микроскопа мало чем отличается от обычного оптического. Возможности светового микроскопа ограничены не качествами линз, а большой длиной световых волн (0,29-0,8 мкм). Малая длина волны электронов (0,0002 мкм и даже меньше) позволяет значительно увеличить разрешающую способность электронного микроскопа. Вместо света в нем используют поток электронов, источником которых является вольфрамовая нить, которая нагревается электрическим током (электронная пушка). Роль линз оптического микроскопа выполняет круговое электромагнитное поле. Пучки электронов, проходят через исследуемый обьект, отклоняются под разными углами в зависимости от неодинаковой толщины и плотности разных участков препарата и попадают в обьективную линзу. В ней появляется первое полезное увеличение обьекта.

После линзы обьектива электроны попадают в промежуточную линзу, которая служит для плавного увеличения изображения. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение обьекта, которое направляется на флюоресцирующий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана возникает видимое изображение обьектов. После наведения четкости проводят фотографирование.

Дата добавления: 2015-09-03 | Просмотры: 4210 | Нарушение авторских прав