 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Концентрування вірусної суспензіїНа наступному етапі потрібно концентрувати розбавлений вірус. Це можна зробити декількома методами, серед яких: - осадження вірусу в ізоелектричній точці; - висолювання; - діаліз; - хроматографія (іонообмінна, афінна); - гель-фільтрація; - диференційне центрифугування (з етапом ультрацентрифугування). Осадження вірусу в ізоелектричній точці. рН отриманої суспензії доводять до ізоелектричної точки вірусу. В результаті цього вірус починає випадати в осад. Витримавши 1-2 год при даному рН суспензію, її центрифугують на невеликих швидкостях протягом 15-30 хв, вірус утворює осад на дні пробірки. Недоліком методу є порівняно малий вихід вірусу (не всі віріони випадають в осад), а також те, що деякі віруси є чутливими до зміни рН, що може призвести до руйнування віріонів. Висолювання. Білкова оболонка вірусу має зовні гідрофобні зони (їх наявність зумовлена амінокислотним складом капсидних білків), які впорядковують навколо себе молекули води у розчині буферу. Внесення у суспензію солей у дуже високих концентраціях призводить до того, що іони солі сольватуються (тобто, відтягують на себе вільні молекули води) і гідрофобні зони капсидних білків вірусу втрачають молекули води. Наслідком цього є агрегація віріонів та їх випадання в осад. Для висолювання найчастіше використовуються сульфати та фосфати, наприклад, сульфат амонію. Недоліком методу може бути відсутність в зовнішніх ділянках капсиду гідрофобних амінокислот, і тоді навіть при дуже високих концентраціях солі вірус не випадатиме в осад. Диференційне центрифугування. На сьогодні цей метод разом з численними модіфікаціями є найбільш уживаним у вірусології. Суть методу полягає у чергуванні циклів низькошвидкісного та високошвидкісного центрифугування. Перший цикл – низькошвидкісний – є, по суті, етапом освітлення первинної суспензії від важких клітинних компонентів (5-10 тис.об/хв, 15-30 хв). Надалі на другому етапі здійснюють високошвидкісне центрифугування (30 тис.об/хв або 100 тис. g, 1-24 год). При цьому все, що є в суспензії (а після першого циклу там має бути мало клітинних компонентів і порівняно багато вірусу), осідає на дно пробірки. Після цього отриманий осад, що містить зконцентрований вірус, розчиняють (ресуспендують) у мінімальному об’ємі буферу, який надалі знову центрифугують на малих швидкостях для видалення не очищених раніше клітинних компонентів. Таким чином, отримується кінцева суспензія вірусу у високій концентрації (вірус з усієї рослини, розтертий, наприклад, у 100 мл буфера, буде зконцентрований до 0.5мл об’єму кінцевої суспензії). При високошвидкісному центрифугуванні вірусний препарат можна наносити на подушку сахарози для кращого очищення суспензії або ж на градієнт сахарози для розділення суспензії на фази.
Завданння. Оволодіти методикою отримання вірусвмісного матеріалу із хворих рослин. Матеріальне забезпечення: рослини тютюну Nicotiana tabacum, Datura stramonium L сорт Імунний 580, Datura stramonium L, Chenopodium amaranticolor, Phaseolus vulgaris L. із симптомами вірусного захворювання, фосфатний буферний розчин рН 7,4, штатив з пробірками, лійки, марля, центрифужні пробірки, піпетки на 1-5 мл, ступки з товкачиком, дезінфікуючий розчин, терези з різноважками, низькошвидкісна центрифуга, еппендорфи. Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 708 | Нарушение авторских прав |