АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Практична робота: Виділення фагів із лізогенних культур

В деяких випадках для виділення фага із лізогенних культур доводиться застосовувати методи індукції профагу (ультрафіолетовим опроміненням або температурою).

Завдання: відпрацювати методику виділення бактеріофагу l з лізогенної культири E. coli.

Матеріальне забезпечення: груші та піпетки, чашки Петрі, бактеріальні петлі, маркери, агаризоване середовище (1,4%), бактеріальні культури (E. coli BE та E.coli K12), ультрафіолетова лампа, термостат.

Хід роботи:

1. Заливають в чашки Петрі 1,4% поживний агар по 2,5-3,0 мл, підсушують. Ділять чашку на 4 сектори та підписують.

2. Стерильною петлею набирають бактеріальні культури (E.сoli К12 та E.сoli BE) зі “скошеного” агару та розсівають методом “штриха” на поверхню поживногог агару в два сектори (рис.3.10.). Обробляють чашки з висіяною культурою ультрафіолетовим випроміненням протягом 10 хвилин.

3. Ті ж культури висівають в третій та четвертий сектори та підписують як контроль К12 та контроль ВЕ. Ставлять на інкубацію (12 год. при 37⁰С).

Рис. 3.10. Розсів бактеріальної культури методом штрихів.

При вірних контролях (в третьому та четвертому секторі спостерігається ріст бактеріальних колоній) проводять облік результатів. В результаті опромінення помірною дозою ультрафіолету бактерії, що несуть профаг, лізуються та вивільняють в оточуюче середовище велику кількість фагових частинок. В тому секторі, на який висівалась лізогенна культура, будуть відсутні колонії бактеріальних клітин. Нелізогенна культура буде формувати нормальні колонії.

Методичні рекомендації:

Найголовнійша вимога при роботі з бактеріями – це стерильность роботи. Всі операції слід виконувати біля полум’я пальника або в стерильному боксі. Лабораторний посуд, інстументарій та поживні середовища попередньо стерилізуються в автоклаві. До початку роботи необхідно обробити робоче місце ультрафілетом та спиртом. Роботу бажано проводити в гумових рукавичках, оскільки E.coli є умовно патогенною бактерією. Перед нанесенням бактерії на поверхню агару, слід ретельно прожирити мікробіологічну петлю.

Оскільки на кришках чашок збирається конденсат, який при зкапуванні на бактеріальний газон може зпотворювати результати титрування, то чашки Петрі ставлять кришками до низу.

К о н т р о л ь н і п и т а н н я

1. Які властивості фагів лежать в основі їх отримання та використання?

2. Чому титрувати фаги потрібно в стерильних умовах?

3. З яких пробірок починають враховувати результати титрування фагу за методом Аппельмана? Чому не більше 24 годин для обліку реакції?

4. Чому метод Граціа більш вживаний, ніж інші методи?

5. Яким чином розмір негативної колонії залежить від розміру фага?

6. Які переваги мають бактеріальні віруси над іншими в аспекті використання їх як модельних об’єктів?

7. Що таке негативна колонія і яким чином вона утворюється?

8. Розвиток подій при лізогенізації фагом l бактеральної культури.

9. Яка роль білка-репресора бактеріофагу l в підтриманні лізогенного стану бактеріальної клітини?

10. Що таке індукція?

11. Яким чином в лізогенній культурі можна виявити профаг?

12. Чи можна інфікувати лізогенну культуру цим же бактеріофагом?

13. В чому відмінність між вірулентними та помірними фагами?

К о н т р о л ь н і з а в д а н н я

1. Визначити титр фагу, коли на ч. Петрі №6 утворилося 16 негативних колоній.

2. Який буде титр фагу, коли на ч. Петрі №7 спостерігається суцільний лізис і в контролі бактерії також відсутній ріст тест-культури?

3. Пояснити чому з часом негативна колонія перестає збільшуватись у розмірі.

4. Порівняти методи титрування бактеріофагів за Апельманом та за Граціа.

5. Скласти схему виділення бактеріофагів, які уражують фітопатогенні бактерії.

Література

1. Луриа С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кемпбелл.Общая вирусология: Пер. с англ. Э. - М.: Мир., 1981.- 680с. с ил.

2. Мекшенков М.И., Серегина Т.М. Генетический контроль развития бактериофага Т4. М.: “Наука”, 1977. 198с.

3. Михайлов А.М., Кафтанова А.С., Корнев А.Н. О строении бактериальных вирусов.- Пущино, 1987.- 152с., ил.

4. Практикум по общей вирусологии. Под ред. И.Г.Атабекова.- М.: Издательство Московского университета. 1981. 192с.

5. Тихоненко А.С. Ультрасруктура вирусов бактерий.- М., «Наука», 1968, 170 с., ил.

6. Mudy M.F. Sheath of bacteriofege T4 // J. Mol. Biol.- 1873.-v. 80. – р. 613-636.

7. Simon L.D., Anderson T.F. The infection of Esherichia coli by T2 and T4 bacteriophages as seen in the electron microscope // I, II, Virology.– 1967.- v. 32. – р.279-305.

8. Crowther R.A,. Lennk E.V., Kikushi Y. Ultrastructure of baseplate of T-even bacteriophage// J. mol. Biol.-1977.- v. 166.- p.489-523.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 648 | Нарушение авторских прав