АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Загальна характеристика вірусів бактерій

Бактеріальні віруси (бактеріофаги) являють собою відносно просту біологічну систему і є зручною моделлю для вивчення основних проблем молекулярної біології, молекулярної генетики тощо. Значні успіхи у вивченні механізмів реплікації нуклеїнових кислот, дослідження тонкої структури генетичного матеріалу, молекулярного механізму мутацій, регуляції білкового синтезу та багато інших досягнень сучасної біології пов’язані з застосуванням бактеріофагів як зручних модельних об’єктів. Ця зручність полягає в наступному:

1) бактеріофаги мають просту, але диференційовану структурну організацію, яка на сьогодні є добре вивченою;

2) вони швидко розмножуються;

3) відомі досить надійні методи накопичення, виділення та очистки бактеріофагів;

4) завдяки простоті організації бактеріальних клітин накопичено багато інформації щодо їх молекулярно-біологічних і генетичних характеристик, тому модель фаг-бактерія широко застосовується у сучасній молекулярній біології.

Бактеріофаги є паразитами представників майже всіх груп прокаріотичних організмів: від крихітних Dellovibrios, які самі паразитують на інших бактеріях, до порівняно великих ціанобактерій.

Виділити бактеріофаг можна з різних матеріалів, де могли в даний момент міститись бактерії, на яких даний фаг розмножується. Так, наприклад, дизентерійні та фаги кишкової палички виявляються в стічних водах, грунті, організмах комах та ін. Стафілококові фаги знаходяться в слизу з носа, на шкірі та в виділеннях з ран. Фаги, що уражують фітопатогенні бактерії, виділяють з рослин.

Для первинного виділення бактеріофагів досліджуваний матеріал гомогенізують, звільняються від великих частинок та фільтрують через бактеріальні фільтри. Отриманий фільтрат засівають разом з відомими бактеріями в рідке поживне середовище. Умови інкубації підбирають оптимальними до бактерії, як правило це 37⁰С протягом 14-18 годин. Для видалення залишків бактерій після інкубації проводять низькошвидкісне центрифугування та фільтрування через бактеріальний фільтр. Для виділення фагів з лізогенної культури часто необхідно застосовувати індукцію виходу профагу, як описано нижче.

Бактеріофаги, як і інші віруси, є облігатними внутрішньоклітинними паразитами і розмножуються виключно в клітинах бактерій. Іх розмноження в рідкому середовищі приводить до того, що культура, яка була мутною перед додаванням вірусу, через декілька годин інкубації стає прозорою. На твердих середовищах фаги вивляють за допомого спот-тесту. При цьому на поверхню агару в чашці Петрі засівають культуру, а потім на неї наносять краплину вірусвмісного матеріалу. На місці нанесення матеріалу будуть або окремі негативні колонії, або велика стерильна пляма, в залежності від кількості вірусу в досліджуваному зразку. Для точного визначення титру вірусу застосовують методи титрування бактерофагів за Апельманом (в рідкому поживному середовищі) та за Граціа (метод подвійних агарових шарів).

Дуже часто виявлені в досліджуваних зразках бактеріофаги являють собою суміш фагів, що відрізняються між собою за біологічними властивостями. Тому після виявлення фага в досліджуваному зразку проводять виділення його “чистої лінії” з подальшим пасируванням даного фагу на чутливій бактерії. В подальшій роботі з даним фагом керуються принципами Д’Ерелля – засновника бактеріофагії. Ці принципи полягають в наступному:

1. Як правило, дія бактеріофагів на бактерії є специфічною – певний бактеріофаг викликає лізис тільки відповідного виду бактерій. Слід відмітити, що серед фагів, які виділяють із хворих на бактеріози рослин також існує чітка родова та видова специфічність. Проте існують виключення, коли той чи інший бактеріофаг здатен лізувати бактерії кількох, звичайно близьких, видів. Фаги даної групи отримали назву полівалентних. Разом з тим, існують типоспецифічні або моновалентні фаги, що здатні лізувати далеко не всіх представників відповідного виду бактерій, а уражують лише певні типи чи навіть штами.

2. Бактеріофаги діють тільки на молоді активно вегетуючі бактерії (виключення - ціанобактерії), що здатні забезпечити в процесі розвитку культури розмноження даного фага.

3. Літична дія бактеріофагів на бактерії призводить до просвітлення мутної бульйонної культури, а на агарових газонах викликає утворення чистих ”стерильних” зон, бляшок різних розмірів, обумовлених ізольованим розвитком потомства кожної початково внесеної на газон фагової частинки. Останні, по аналогії з утворенням бактеріальних колоній при розмноженні бактерій, що виросли на агарі, одержали назву негативних колоній фага. Кількість цих негативних колоній вказує на кількість фагових часток, що міститься в 1мл середовища.

4. При лізисі бактеріальної культури фагом серед великої кількості фагочутливих клітин може зустрічатися якась кількість стійких особин, що при дальшому розмноженні можуть спотворювати картину дії фага. Від таких клітин обов’язково звільняються шляхом фільтрації, прогріванням або ж обробкою хлороформом.

Характер негативних колоній виділених фагів може попередньо вказувати на деякі властивості фагів (рис.3.1.). Так, чисті, прозорі негативні колонії вказують на належність фагів до вірулентної групи, а мутні, з ореолом по периферії можуть говорити про виділення помірних фагів, які здатні переходити в форму профага і лізогенізувати бактеріальні культури. Крім того, розмір негативної колонії незалежно від її характеру, може говорити про розмір вірусних часток, які достовірно вивчають за допомогою методу електронної мікроскопії. Оскільки фаги маленьких розмірів порівняно швидко дифундують в агарі, то в результаті їх діяльності утворюються негативні колонії великого розміру (1,5-10 мм). До фагів цієї групи належать бактеріофаг C_Δ та Т1. На противагу цьому, невеликі негативні колонії розміром 1-2 мм утворюются крупними бактеріофагами типу Т2 та Т4.

Загальні властивості фагів зазвичай слугують відображенням властивостей клітини-господаря. Наявність жорсткої клітинної стінки у більшості бактерій потребує особливих механізмів проникнення або виходу вірусів.

Прикріплення фагу до бактеріальної клітини відбувається на клітинній поверхні. Оскільки клітинна поверхня відрізняється у різних бактерій, то існують різні способи взаємодії фагу з бактеріальою клітиною. Так, деякі фаги приєднуються до особливих виростів, так званих L- та F-ворсинок, які приймають участь в процесі кон’югації. Віріони інших фагів зворотньо прикріплюються до джгутиків бактерії і потім сковзаються вздовж них, при чому цьому процесу, швидше за все, сприяють рухи самих джгутиків. На поверхні бактеріальної клітини є специфічні рецептори для бактеріофагів, проте дані про їх природу досить обмежені. Проникнення геному бактеріофагу в клітину супроводжується фізичним відокремленням нуклеїнової кислоти від капсидних білків, які залишаються зовні клітини. Крім нуклеїнової кислоти фага, всередину клітини потрапляє невелика кількість білку та деякі інші речовини, в тому числі олігопептиди та поліаміни.

Оскільки бактеріальні клітини здатні поглинати з середовища вільну ДНК, то і геном фага може проникнути таким чином в клітину. Це явище отримало назву транфекції. Здатність бактерій поглинати молекули ДНК може виникнути як нормальне явище на певних етапах росту, наприклад у В. subtilis. В деяких випадках це явище викликається штучно, як, наприклад, у Е. coli.

Проникнення геному бактеріофагу в чутливу бактерію приводить до розвитку або літичної, або лізогенної інфекції, в залежності від природи фага (іноді бактерії) та умов оточуючого середовища.

При лізогенному типі взаємодії геном фагу в неінфекційній формі передається бактеріальними клітинами з покоління в покоління, причому час від часу в деяких клітинах синтезуються віріони, що лізують ці клітини та виходять в зовнішнє середовище. Лізогенні клітини стають імунними до повторного зараження цим же бактеріофагом і лізогенні культури продовжують нормально рости. Присутність вільних віріонів можна виявити шляхом інфікування індикаторної культури. Бактеріофаги, що здатні переходити в лізогенний стан, називають помірними, фаги, у яких така властивість відсутня – вірулентними. Слід відміти, що навіть помірні фаги при першій інфекції чутливих до них бактерій викликають продуктивну інфекцію у багатьох або навіть всіх клітин. Виникнення лізогенії вимагає серії певних подій. Ймовірність появи лізогенії та продуктивної інфекції варіює у різних фагів та залежить від умов культивування.

Найкраще вивченим серед вірулентних фагів є бактеріофаг Т4, будова якого наведена на рис.. Основні компоненти бактеріофагу Т4: головка, що містить нуклеїнову кислоту (ДНК); відросток – виконує функцію введення генетичного матеріалу в клітину Е.coli; конектор, який поєднує головку бактеріофагу з відростком; базальна пластинка з фібрилами – апарат пошуку, фіксації та подачі сигналу для введення нуклеїнової кислоти в клітину.

Рис.3.1. Будова бактеріофагу Т4.

1. головка; 2. конектор; 3. стержень хвостового відростку;

5.чохол хвостового відростку; 5. базальна пластинка;

6. зубець базальної пластинки; 7. довга фібрила.

8. коротка фібрила.

Життєвий цикл бактеріофагу Т4 став класичним прикладом онтогенезу вірусів. Експеримент, вперше проведений Еморі Елліс та Максом Дельбрюком, дозволив встановити загальну послідовність подій. Клітини E.coli, що активно ростуть, заражали бактеріофагом так, щоб в середньому на одну клітину приходилось по одній фаговій частинці. Протягом двох-трьох хвилин інкубації більшість фагів адсорбувались на клітинах. Всі неадсорбовані фаги потім інактивували, додаючи антифагову сироватку. Через декілька хвилин після цього культуру розбавляли в більше ніж сто разів, щоб зменшити концентрацію антитіл та попередити інактивацію фагового потомства. Через певні проміжки часу в пробах інфікованої культури визначали концентрацію інфікуючих одиниць шляхом висіву проб на чашки з індикаторними бактеріями та підрахунку числа негативних колоній на бактеріальному газоні. Результати даного експерименту графічно представлені на рис.3.2. Протягом 24 хв. після адсорбції бактеріофагу на клітині число інфекційних одиниць в культурі залишалось стабільним. В цей період кожна негативна колонія утворювалась окремою інфікованою клітиною, з якої потомство фага виходило після того, як клітина виявлялась на поверхні агару. Через 24 хв. число інфекційних одиниць починало рости, оскільки деякі інфіковані клітини лізуються та вивільняють бактеріофаги. На 30-й хвилині всі інфіковані клітини були вже зруйновані. Число інфекційних одиниць до кінця досліду приблизно в сто разів перевищувало число інфікованих клітин. З кожної клітини виходило приблизно сто фагових потомків.

Рис.3.2. Одиночний цикл розвитку бактеріофагу Т4.

Першим етапом взамодії бактеріофагу Т4 з клітиною є адсорбція (рис.3.3.). В інтактному стані бактеріофагу довгі фібрили обвиваються навколо відростка таким чином, що їх середня частина підтримується корткими фібрилами, прикріпленими до того місця, де головка з’єднується з відростком. Можливо, при контакті кінців фібрил з рецепторами клітини нитки розправляються і випрямляються. Для цього необхідний L-триптофан як кофактор. Для наступного етапу взаємодії фагу з бактерією необхідне правильне просторове положення базальної пластинки, що забезпечується, очевидно, контактом усіх шести ниток з рецепторами клітини. Слід зауважити, що необернене прикріплення бактеріофагу до клітини і проникнення в неї ДНК відбувається лише на окремих ділянках оболонки (всього їх приблизно 300), де цитоплазма і зовнішні мембрани утворюють міцні контакти, стійкі до м’якого осмотичного шоку.

а б в г

Рис. 3.3. Схема основних етапів адсорбції фагу Т4 на бактерії E.coli.