АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Практична частина. Методи титрування бактеріофагів

Методи титрування бактеріофагів

Активність бактеріофагу визначають за його властивістю викликати лізис бактеріальної культури в рідких або твердих середовищах і чисельно виражають ступенем максимального розведення, в якому досліджуваний фаг проявив свою літичну дію. Вид середовища, як правило, визначається здатністю певного фагу лізувати культуру в рідкому чи твердому поживному середовищі.

При дослідженні в рідкому середовищі (за Аппельманом) титр фагу– це найбільше його розведення (або найменша кількість), яке повністю стримує (пригнічує) ріст тест-культури в умовах даного досліду.

На твердому середовищі (титрування за Граціа) титр фагу – кількість часток фагу в 1 мл досліджуваного матеріалу.

Титрування фагу за методом Аппельмана

(рідке середовище)

Завдання: опанувати методику титрування бактеріофагів в рідкому поживному середивищі, визначити титр бактеріофагу Т4.

Матеріальне забезпечення: Пробірки з ватно-марлевими пробками, штатив, груші та піпетки (самплери та носики), маркери, поживне середовище (LB), нічна бактеріальна культура, бактеріофаг, термостат.

Хід роботи:

В 9 стерильних пробірок вносять по 4,5 мл поживного середовища. Пробірки ставлять в штатив і нумерують від 1 до 7, на 8 пробірці ставлять позначку КК (контроль культури), на 9 - КФ (контроль фагу). Всі дослідні пробірки повинні бути підписані.

2. В пробірках під номерами від 1 до 7 готують послідовні десятикратні розведення фагу від 10¹ до 10⁷. В першу пробірку вносять 0,5 мл фагу. Таку ж його кількість вносять в пробірку контролю фагу під №9. Замінивши піпетку новою, ретельно перемішують вміст 1-ї пробірки і переносять 0,5 мл його в 2-гу пробірку, 0,5 мл вмісту 2-ї пробірки переносять в 3-тю і так далі до 7-ї пробірки. Кожен раз необхідно брати нові піпетки (або носики). Перемішавши вміст 7-ї пробірки, 0,5 мл розведення із неї виливають в дезрозчин. Так само чинять із вмістом пробірки №9 - контролем фагу (рис. 3.8).

Рис.3.8. Результати титрування бактеріофагів за Апельманом

3. У всі пробірки досліду, крім пробірки №7, вносять по 1 краплині (0,05 мл) суспензії тест-культури. Внесення культури проводять однією піпеткою з пробірки № 9 до №1. Пробірки разом із штативом струшують. У всіх пробірках досліду, крім пробірки на контроль фагу, повинна з’явитись ледь помітна мутність.

4. Пробірки ставлять в термостат на 18-20 годин, після чого проводять облік результатів титрування, розпочинаючи з контролів.

При титруванні фагу ставлять такі контролі: контроль фагу і середовища на стерильність, контроль тест-культури на її життєву активність.

При правильній постановці досліду в контролі культури відбулося інтенсивне розмноження бактерій і вона стала мутною, що добре видно візуально. Цей контроль дозволяє зробити висновок, що тест-культура, на якій титрували фаг, життєздатна, поживне середовище забезпечує їй оптимальний розвиток в умовах досліду. Виходячи із результатів росту тест-культури в контролі, можна зробити висновок: якщо в пробірках з фагом культура не виросла, то на неї подіяв фаг. Рідина в пробірці з контролем на фаг повинна лишатись прозорою. Це дозволяє зробити висновок, що посуд, середовище і фаг стерильні.

Враховують характер змін в титраційному ряду пробірок від №1 до №7 (рис.). Ріст культури в пробірках титраційного (дослідного) ряду свідчить про відсутність в них фагу. Визначають титр фагу, тобто його найбільше розведення, яке здатне викликати лізис культури (вміст пробірки в порівнянні з контролем на ріст культури прозорий). Позначається титр фагу степенем розведення фагу з від’ємним знаком, що відповідає порядковому номеру пробірки. Наприклад, якщо в перших чотирьох пробірках титраційного ряду відсутній ріст культури, а в наступних пробірках культура росте, то титр фагу буде 10⁴ фагових частинок на мілілітр (рис.).

Методичні рекомендації:

Найголовніша вимога при роботі з бактеріями – це стерильність роботи. Всі операції слід виконувати біля полум’я пальника або в стерильному боксі. Лабораторний посуд, інстументарій та поживні середовища попередньо стерилізуються в автоклаві. До початку роботи необхідно обробити робоче місце ультрафілетом та спиртом. Роботу бажано проводити в гумових рукавичках, оскільки E.coli є умовно патогенною бактерією.

При розведенні бактеріофагу необхідно кожного разу брати нову піпетку (носик для самплера). Після додавання фагу в поживне середовище слід ретельно перемішати вміст пробірки. При титруванні фагу об’єм і склад середовища, температура, аерація, кількість бактерій повинні бути однакові. Змінною є тільки кількість внесеного фагу.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 828 | Нарушение авторских прав