АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Екстракція вірусів з рослини

Під екстракцією вірусу з рослини розуміється механічне руйнування тканин рослин (клітинних стінок і т.п.) для того, щоб вірус з клітин вийшов у отриманий рослинний сік. Механічне подрібнення тканини може відбуватися декількома шляхами, головними серед яких є перетирання у ступці та подрібнення у гомогенізаторі. Вибір методу гомогенізації залежить від морфології досліджуваного вірусу. Якщо віріони ниткоподібні і великої довжини, то гомогенізатори не можна використовувати, оскільки це може призвести до руйнування віріонів. Перетирання проводиться з додаванням буферного розчину для підтримання постійного значення рН, оскільки при перетиранні вивільняються рослинні ферменти і рН зменшується у кислу сторону. Вибір буферу знову ж таки регламентується досліджуваним вірусом. Для кожного вірусу властиве своє значення ізоелектричної точки (таке рН розчину, при якому урівноважуються позитивні та негативні заряди поверхні віріонів і вони випадають в осад). Тому потрібно підбирати такий буфер для екстракції вірусів, щоб його рН не співпадало зі значенням ізоелектричної точки вірусу. Ізоелектрична точка більшості вірусів рослин знаходиться в кислій зоні, тому для їх екстракції використовують буфери з нейтральною або помірно-лужною реакцією. Найчастіше використовуються фосфатний буфер (рН 7.4), тріс-боратний (рН 8.4), цитратний, карбонатний (рН 9.6), гліциновий, трісовий та ін. Як вже було сказано, при перетиранні рослинних тканин вивільняються рослинні ферменти (поліфенолоксидази, каталази, пероксидази та ін.), які сприяють зниженню рН та безпосередньо руйнують віріони. Тому у буферні розчини рекомендується додавати хелатуючі речовини (наприклад ЕДТА), які інактивують рослинні ферменти. Це дозволяє утримати рН на потрібному рівні (тобто, вірус не випаде в осад при досягненні його ізоелектричної точки) і збільшити загальний вихід вірусу з тканини.

При виділенні вірусів рослин зазвичай наважку рослини розтирають у подвійному об’ємі відповідного буферу. Тобто, наприклад, 50 грамів рослинної тканини перетирають у 100 мл буферу.

Слід також зазначити, що гомогенізація тканини, як і всі наступні операції при виділенні та очищенні вірусів, повинні проводитися на холоді при 0-4˚С. Для цього використовують охолоджений інструментарій, а тканини бажано гомогенізувати в рідкому азоті.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 618 | Нарушение авторских прав