АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Культуральное исследование

3.3.1 Культуральное исследование дает положительные результаты при наличии 20-100 микобактерий в 1 мл исследуемого материала.

3.3.2. Для получения чистых культур микобактерий материал подвергают предварительной обработке.

Из каждого доставленного в лабораторию лимфатического узла и участка ткани вырезают кусочки размером 0,5-0,7 см³ на границе здоровой и измененной ткани. Общая масса отобранного материала для исследования составляет не менее 10 г. (1/4 часть объема средней по величине ступки).

Материал от животных высевают по следующей схеме:

а) Отбирают материал для бактериологического исследования от убитых животных, не имевших изменений при убое, отдельно от каждой туши и высевают на 10-15 пробирок среды каждую пробу (материал от каждого животного) по следующей схеме:

- лимфатические узлы головы (подчелюстные, заглоточные);

- бронхиальные и средостенные лимфатические узлы;

- мезентеральные (брыжеечные) лимфоузлы;

- прочие лимфоузлы (при наличии подозрительных участков);

- органы (тоже при необходимости).

б) Непосредственно при бактериологическом посеве материала вырезают кусочки с нарушенной морфологической структурой лимфатического узла или органа (гиперплазия, уплотнение, точечные и полосчатые кровоизлияния и т.д.). Причем необходимо вырезать все измененные участки. Если материала по объему получается много в одну ступку, то его можно разделить в две.

в) Строго соблюдают взятую для работы методику, не нарушая режим обработки и высева материала.

г) При гомогенизации материала, особенно лимфатических узлов, необходимо использовать стерильный песок или мелкобитое стерильное стекло. Максимально растирают материал (до сметанообразной консистенции) для лучшего извлечения микобактерий из исследуемого материала

д) Добавляют физраствор к гомогенизированному материалу в ступку в количестве, необходимом для высева взвеси материала на питательные среды и для биопробы (в среднем до 0,5 см³ в одну пробирку и 1-2 см³ для подкожного заражения одной морской свинки). Это количество физраствора можно рассчитывают заранее.

е) Высевают взвесь материала пастеровскими (или мерными) пипетками, насасывая взвесь резиновой грушей (но не ртом!).

ж) Просмотр посевов материала проводят через 3, 5, 7, 10, 15 дней и в дальнейшем один раз в неделю.

з) Любая выросшая на среде колония микроорганизмов (типичная или атипичная, пигментная или беспигментная, слизистая или суховатая и т.д.) должна пройти микроскопию при избирательной окраске по Цилю-Нильсену.

Следует обратить внимание на степень отмывки материала от кислоты (или щелочи), применяемой для обработки материала от контаминации посторонней микрофлорой. Остаточное количество кислоты всегда будет присутствовать во взвеси из высеваемого материла, однако оно должно быть минимальным. Показателем этого служит восстановление первоначального цвета среды на 2-4-ый день после посева материала. Если цвет среды не восстановился, это свидетельствует о повышенном количестве остаточной кислоты. Цвет среды приобретает синеватый оттенок различной интенсивности. Рост (предполагаемых) микобактерий в данном случае замедляется, либо его не будет вообще, особенно возбудителя туберкулеза как более требовательного к режиму культивирования. Остаточное количество кислоты действует на микобактерии в некоторой степени бактериостатически.

Для герметизации пробирок после посева материала применяют ватные и ватно-марлевые пробки с последующей заливкой их парафином, резиновые с вырезанным косым желобком и резиновые без него, можно корковые и металлические пробки (затворы).

Метод А.П. Аликаевой. Кусочки материала нарезают кусочками по 0,5-0,7 см³, помещают в ступку и заливают 3-6 %-ным раствором серной кислоты на 10-20 мин, ступку накрывают листом стерильной пергаментной бумаги. Затем кислоту сливают, материал промывают 3 раза в течение 5-10 мин физиологическим раствором, после чего раствор удаляют и кусочки ткани тщательно растирают со стерильным песком или стеклом. Из гомогената из каждой ступки делают мазок. Затем добавляют незначительный объем физиологического раствора из расчета 0,5 см³ на одну пробирку со средой. Из полученной взвеси делают посевы и заражают животных (1-2 мл на одно животное).

Метод Гона-Левенштейна-Сумиоши. Кусочки материала измельчают ножницами в ступке, тщательно растирают пестиком со стерильным песком или стеклом и заливают в зависимости от свежести материала 3-6 %-ным раствором серной кислоты или 5-10%-ным раствором щавелевой кислоты в соотношении: на 1 объем материала - 4 объема кислоты. Затем центрифугируют в течение 10-15 мин при 3000 об/мин. Общая экспозиция воздействия кислотой не должна превышать 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок отмывают 2-3 раза физиологическим раствором центрифугированием при том же режиме и используют для посевов, нанося и растирая его бакпетлей или шпателем на поверхности яичной среды.

Метод флотации. Применяют для концентрации микобактерий в исследуемом материале. Кусочки материала растирают в ступке с физиологическим раствором до консистенции сметаны, 10 мл суспензии помещают в узкогорлую колбу вместимостью 250 мл и добавляют 10 мл 1%-ного раствора едкого натра. Смесь в течение 10 мин (не более) тщательно встряхивают в шуттель-аппарате до получения однородной взвеси. Затем гомогенизированный материал разбавляют в соотношении 1:9 физиологическим раствором и прибавляют 1-2 мл ксилола или авиационного бензина. Смесь снова встряхивают 5-10 мин, добавляют физиологический раствор до горлышка колбы и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Микобактерии туберкулеза концентрируются во флотационном кольце у горлышка колбы.

Для приготовления мазков содержимое образовавшегося кольца осторожно отсасывают пипеткой и наносят по мере подсыхания несколько раз на предметное стекло. Для посевов на питательные среды пенистую часть флотационного кольца переносят пастеровской пипеткой в стерильные пробирки, добавляя приблизительно равное количество 3-6 %-ного раствора серной кислоты. Пробирки тщательно встряхивают в течение 3-5 мин и оставляют на 10 мин. Содержимое вновь образовавшегося компактного кольца засевают петлей-ракеткой в пробирки с питательной средой.

Аналогично исследуют дополнительный материал от животных, пробы кормов и внешней среды.

3.3.3. Для выращивания микобактерий используют плотные яичные среды: Левенштейна-Йенсена, Гельберга, ФАСТ-ЗЛ, Финн-2, Петраньяни (см. Приложение № 4).

3.3.4. Подготовленный для исследования материал из каждой ступки высевают в 10-15 пробирок с одной из вышеуказанных сред. Посев проводят пастеровской пипеткой, внося около 0,5 см³ взвеси материала в каждую пробирку или платиновой петлей, осторожно растирая материал по всей поверхности питательной среды. Засеянные пробирки помещают в термостат при температуре 37-38°С и укладывают в наклонном положении. Через 2 суток посевы просматривают, определяют восстановление цвета среды и ресуспензируют взвесь по ее поверхности. Если цвет среды не восстановился, обработку и посев повторяют. Пробирки, в которых появился рост посторонней микрофлоры, удаляют. В остальных ватно-марлевые пробки парафинируют.

3.3.5. Посевы инкубируют в течение 3 месяцев. Для выявления начального роста микобактерий пробирки с посевами просматривают через 3, 5, 10, а затем не реже одного раза в неделю. Рост микобактерий туберкулеза бычьего вида чаще обнаруживают на 20-60 сутки, человеческого на 20-30, птичьего - на 10-20, атипичных микобактерий - на 3-30 сутки.

3.3.6. У выделенных первичных культур изучают и описывают свойства по следующей схеме:

а) сроки обнаружения первичного роста;

б) характер роста - отдельные колонии, скопления их, сплошной рост;

в) характеристика колоний:

величина - мелкие, крупные;

форма - круглая, звездчатая, с неравными краями;

поверхность - гладкие, влажные, шероховатые, сухие, складчатые;

рельеф - плоские, выпуклые, шаровидные;

консистенция - крошковатые, вязкие, слизистые

пигментообразование - непигментированные, пигментные (цвет);

эмульгируемость в физиологическом растворе - отсутствует, слабая, хорошая;

г) тинкториальные свойства при окраске по Цилю-Нильсену;

д) морфология микобактерий:

длина - длинные, короткие, коккоподобные;

толщина - тонкие, толстые;

форма - прямые, изогнутые, ветвящиеся, расположенные под углом;

количество - единичные клетки, небольшие скопления, кучки.

3.3.7. Микобактерий туберкулеза бычьего вида в первых генерациях растут скудно, через 20-60 суток, в виде мелких, гладких, шаровидных, цвета слоновой кости колоний. Реже встречаются культуры, образующие шероховатые колонии.

Для микобактерий туберкулеза человеческого вида характерен интенсивный узелковоподобный, шероховатый, сухой рост (через 20-30 суток) культуры цвета слоновой кости. Это R-формы (шероховатые) колоний. Иногда встречаются S -формы (гладкие) колоний.

Культуры микобактерий туберкулеза птичьего вида растут быстрее (10-20 суток), чем микобактерий туберкулеза бычьего и человеческого видов. Колонии мягкие, слизистые, беловатые, реже слегка желтоватые, иногда с пуговицеобразным возвышением и кратеровидным углублением (форма «тюрбана»).

3.3.8. Для дальнейшего изучения культуральных свойств микобактерий накапливают бактериальную массу выросших колоний на яичной среде. Для пересева отбирают колонии, наиболее характерные по внешнему виду для микобактерий туберкулеза.

Для дифференциации культур возбудителей туберкулеза бычьего, человеческого, птичьего видов и атипичных микобактерий, накопленную бакмассу пересевают на различные питательные среды (яичные, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА) и яичную среду с салицилатом натрия) и культивируют их при разных температурных режимах: 20-22°, 37-38° и 45 °С или используют упрощенную схему дифференциации микобактерий с учетом результатов биопробы (см. Приложение №5), а так же определяют способность выделенной культуры к образованию корд-фактора, который формируют только возбудитель туберкулеза человеческого и бычьего видов.

Для его выявления из жидкой части на дне пробирки с ростом микобактерий на ее поверхности (пленка или сплошной влажноватый рост) переносят аккуратно бактериологической петлей 1-2 капли взвеси на предметное стекло, дать мазку высохнуть, фиксируют над пламенем спиртовки и красят по Цилю-Нильсену. Если на уровне жидкой части (на границе) признаков роста микобактерий нет, а они растут на среде в средней и верхней части пробирки, то аналогично переносят на предметное стекло 1-2 капли взвеси с нижней части пробирки (можно просто 1-2 капли стерильного физиологического раствора), бактериологической петлей берут колонию (или ее часть), переносят в каплю на предметное стекло, гомогенизируют (растирают, разбивают) бакмассу, высушивают мазок на воздухе, фиксируют над пламенем спиртовки и красят.

Можно выросшие колонии микобактерий пересеять на жидкую (Моделя, Сотона) или полужидкую (Школьниковой) среду и при проявлении роста культуры в виде нежной беловатой пленки на поверхности аналогично готовят из ее мазки.

При просмотре мазков корд-фактор (фактор вирулентности) обнаруживают в виде нежных длинных «кос», «жгутов», «веревок», «паучков» и т.д. и их обрывков на общем фоне отдельных больших и малых групп микобактерий и хаотичного их расположения в поле зрения микроскопа (см. Приложение №3).

Для пересева платиновой петлей (диаметр 2-3 мм) снимают 1-2 петли культуры и переносят в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон. Бактериальную массу тщательно растирают в 1-1,5 мл физиологического раствора, который добавляют небольшими порциями в пробирку (флакон).

Приготовленную взвесь вносят пастеровской пипеткой по 2-3 капли в девять пробирок со средой Левенштейна - Йенсена (по 3 пробирки на каждый температурный режим), в три пробирки яичной среды с салицилатом натрия, в три пробирки с МПА и МПБ. На пробирках делают надписи с указанием номера экспертизы, даты пересева и температурного режима культивирования. Пробки парафинируют и пробирки устанавливают в термостат при заданных температурах. Пробирки с посевами на мясопептонный 'бульон, мясопептонный агар и на яичную среду с салицилатом натрия инкубируют в термостате при 37°С.

При пересевах учет появления роста в первые 10 суток культивирования проводят каждые двое - трое суток и каждые пять дней в последующие три недели.

Характер роста на яичных средах и МПА определяют и описывают по той же схеме, что и первичные культуры, а на МПБ - в следующем порядке:

пленка - наличие, отсутствие;

интенсивность развития пленки - тонкая, умеренно развитая, толстая;

поверхность пленки - гладкая, зернистая, морщинистая;

цвет пленки;

нити (наличие и характер): тонкие, толстые, короткие, длинные,

осадок - плотный, рыхлый, хлопьевидный, цвет;

изменение среды культивирования - помутнение, цвет.

Помутнение среды указывает на загрязнение культуры. Микобактерии туберкулеза всех трех видов не образуют пигмент и растут на яичных средах без салицилата натрия, М. tuberculosis и М. bovis растут при температуре -37-38°С, М. avium при температурах - 22 °С, 37-38°С и 45 °С, микобактерии туберкулеза птичьего вида также растут на яичной среде с салицилатом натрия. М. tuberculosis и М. bovis не растут на МПБ и МПА, на этих средах допускается слабый рост микобактерии птичьего вида.

Атипичные микобактерии растут в первые 3-7 дней после посева при разных температурах на яичных средах, а некоторые - на яичной среде с салицилатом натрия, МПБ и МПА.

На основании характера роста культур на питательных средах дифференцируют возбудителей туберкулеза бычьего и человеческого видов от других микобактерии (возбудитель туберкулеза птичьего вида и атипичные микобактерии). Основные культуральные свойства микобактерии приведены в приложении № 5 и №6.

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 654 | Нарушение авторских прав