АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ

Основные методы оценки Т- и В-систем иммунитета связаны с определением количества и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов. В связи с этим важной процедурой подготовительного этапа является выделение чистой суспензии лимфоцитов периферической крови.

К числу наиболее употребительных относится метод выделения клеток на градиенте плотности фиколлпака. Смешивая фиколл и пак в определенной пропорции, получают раствор, имеющий плотность 1.077 г/см. Центрифугируя периферическую кровь после наслаивания на градиент, удается разделить клетки, имеющие плотность ниже (лимфоциты, моноциты) и выше (эритроциты. гранулоциты), чем 1.077 г/см.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моноциты выделяли из побочных продуктов приготовления консервов крови – лейкоцитной пленки. Лейкоцитную пленку разводили буфером PBS, содержащим Ca2+ и Mg2+ (Biochrom) в соотношении 1:1. Полученную суспензию (35 мл) наслаивали на 15 мл фикола плотности 1.077 (Biochrom) в пробирке LeucosepTM (Greiner). Образцы центрифугировали 30 мин (Backman Coulter) при 650xg. Мононуклеарную фракцию собирали с интерфазы фикол/сыворотка, переносили в свежие пробирки и два раза отмывали буфером PBS. Во время первого центрифугирования готовили непрерывный градиент на основе перкола (PercollTM GE Healthcare). Полученную смесь помещали в 50 мл пробирку и центрифугировали при 12000xg в течение 10 мин при 200С с отключенными тормозами в роторе F34-6-38 (Eppendorf). Отмытые клетки (5-8x108) ресуспендировали в 5 мл PBS и наносили на полученный градиент. Градиенты центрифугировали при 650xg в течение 30 мин при 200С с отключенными тормозами. В результате центрифугирования популяция клеток разделялась на две фракции. Фракция, находившаяся в верхней части градиента содержала клеточную суспензию обогащенную моноцитами до 60-80%. Эту фракцию собирали, и 3 раза отмывали буфером PBS. Полученная клеточная популяция была использована для некоторых экспериментов напрямую. При необходимости получения популяций клеток, содержащих более 90% моноцитов, обогащенная моноцитами фракция, использовалась для магнитной сортировки CD14+ клеток при помощи набора для выделения моноцитов (Miltenyi Biotech). Полученная таким образом клеточная популяция содержала 92-95% моноцитов, что контролировалось при помощи анализа поверхностной экспрессии маркера моноцитов CD14. Макрофаги культивировали в концентрации 1x106 клеток/мл в бессывороточной среде X-VIVO 10TM (Cambrex), содержащей цитокины.

Для получения кДНК использовались наборы для синтеза кДНК фирмы Invitrogen, содержащие обратную транскриптазу SuperScript II или SuperScript III. Применение этих наборов позволяло получать достаточное количество кДНК при использовании 100 нг тотальной РНК. Синтез проводился в строгом соответствии с рекомендациями производителя. Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием коммерческих реагентов для определения цитокинов CCL18, IL-1, IL-1ra, ФНО. Олигонуклеотиды для определения GAPD- гена, использовавшегося для нормализации полученных данных, представлены в Приложении Б. Для постановки реакция использовали готовую реакционную смесь фирмы AppliedBiosystems(Darmstadt, Germany). Концентрацию цитокинов в культуральной среде определяли при помощи наборов для ELISAфирмы R&Dsystems(Wiesbaden, Germany).

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 702 | Нарушение авторских прав