АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение протеолитической активности микробов

а) На желатине. Мясопептонный желатин разливают в

пробирки столбиком по 5— 6 мл. Посев производят

уколом, погружая петлю с исследуемой культурой в

глубь питательной среды до дна пробирки. Микробы,

способные расти при низкой температуре, оставляют

стоять в комнате при 20—22°С. Остальные посевы ин-кубируют в термостате при 37 °С. Вместе с опытными

пробирками в термостат ставят одну или две пробирки с

незасеянным желатином для контроля. При температуре

37 °С желатин плавится, поэтому после инкубации

пробирки, вынутые из термостата, опускают в холодную

воду или ставят в холодильник. После застудневания

желатина в контрольных пробирках приступают к

просмотру роста и учету изменений в питательной среде

опытных пробирок. Там, где под действием фермента

желатиназы произошло расщепление белков желатина,

отмечается разжижение питательной среды. Пробирки,

в которых после суточного инкубирования среда

остается без изменения, оставляют в термостате, наблю-дение за изменением среды ведется в течение 20 сут. В

протоколе исследования обязательно отмечают день

появления признаков разжижения среды, степень и

характер ее разжижения.

б) На молочном агаре Эйкмана. Молочный агар

Эйкмана, разлитый и остуженный в чашках Петри,

засевают исследуемой культурой микробов. Посев

делают петлей или шпателем так, чтобы получить

изолированные колонии. Через 24—48 ч инкубации в

термостате культуры, продуцирующие

протеолитический фермент, обусловливают

пептонизацию молочного белка — казеина, в результате

чего вокруг таких колоний образуются прозрачные

зоны, четко выделяющиеся на общем молочно-мутном

фоне среды.

в) На свернутой кровяной сыворотке. Культуру

исследуемых аэробных микробов засевают на чашки,

анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной

сыворотки, инкубируют в термостате при 37 °С. Штам-мы, продуцирующие протеолитические ферменты,

разжижая питательную среду, образуют углубления

вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

г) В бульоне с куриным яичным белком. В пробирку с

мясопептонным бульоном или бульоном Хоттингера,

содержащим кусочек свернутого куриного белка, вносят

одну петлю исследуемой культуры микроба. Посевы

просматривают ежедневно в течение 5 дней.

Протеолитически активные культуры микробов

расщепляют коагулированный яичный белок; кусочки

белка, содержавшиеся в среде, заметно уменьшаются в

размере, превращаясь в крошкообразную массу, или

полностью растворяются. Аналогичным образом

проявляются протеолитические свойства микробов в

средах с кусочком вареного мяса.

Некоторые виды патогенных микробов с

выраженной протеолитической активностью обладают

способностью расщеплять белок и пептон до продуктов

глубокого распада: индола, сероводорода, мочевины и аммиака. При определении видов и дифференциации разновидностей патогенных микробов наибольшее значение имеет выявление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола в культуре микроорганизмов.

Индол образуется при расщеплении сложной

гетероциклической кислоты - триптофана. Для

выявления индолообразования петлю исследуемой

культуры засевают в среду Строгова или другие среды,

рекомендуемые для обнаружения индола. Тотчас после

посева в пробирку вносят полоску индикаторной

бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты,

так, чтобы индикаторная бумага не касалась

питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной

полоски прижимают пробкой к стенке пробирки.

Посевы инкубируют 24—48 ч при температуре 37°С.

Образование индола определяют по окрашиванию

нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый

цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Определение сероводорода. Сероводород является

конечным продуктом расщепления аминокислот:

цистина, цистеина и метионина, содержащих серу.

Петлю исследуемой культуры микробов засевают в

пробирку с мясопептонным бульоном или бульоном

Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят

пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной

бумаги на определение сероводорода. В положительных

случаях образующийся в культуре сероводород вступает

в соединение с бесцветным ацетатом свинца и

превращается в сульфат свинца, который придает

индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

Окончательный учет результатов на образование индола

и сероводорода проводят на 7—10-й день после посева,

так как процесс ферментативного расщепления белка и

образования конечных продуктов распада происходит

иногда в течение длительного времени.

Окислительно-восстановительные свойства

микроорганизмов. В культуре микробов могут быть

обнаружены окислительно-восстановительные

ферменты, связанные главным образом с дыхательной функцией микроорганизма. Как известно, процесс окисления субстрата может происходить посредством присоединения к нему кислорода с участием ферментов оксидаз или в результате отщепления от него водорода с участием ферментов дегидраз. Для этого типа реакции характерно то, что окисление какого-либо одного вещества всегда сопровождается восстановлением (ре-дукцией) другого органического вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называют донором, а то вещество, к которому он присоединяется, - акцептором. Акцептором водорода чаще всего является кислород воздуха, однако им могут быть также многие органические соединения, способные легко

окисляться и восстанавливаться. С целью выявления

ферментов дегидраз и определения их активности в

практике микробиологических исследований предложен

метод, основанный на введении в питательную среду

органической краски, выполняющей роль акцептора

водорода. В результате присоединения водорода

краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное

соединение, называемое лейкобазой. При обильном

доступе кислорода оно может вновь окислиться и

приобрести прежний цвет. В качестве акцептора

водорода используют метиленовый синий, лакмусовую

настойку, малахитовый зеленый, индиго-кармин,

нейтральный красный и др. Для выявления

редуцирующих свойств микроорганизмов указанные

красители добавляют к обычным питательным средам:

мясопептонному бульону, мясопептонному агару,

молоку. Один и тот же вид микроба ведет себя

неодинаково по отношению к краскам разного состава.

Это свойство микроба использовано в

микробиологической практике в качестве

дифференциального признака. Бактерии брюшного

тифа редуцируют метиленовый синий, но не

редуцируют лакмуса и не изменяют нейтрального

красного в противоположность кишечной палочке,

которая остается нейтральной в отношении

метиленового синего, но восстанавливает лакмус и

нейтральный красный.

Определение редуцирующей способности.

1. В 5 мл среды - молока с метиленовым синим -

засевают петлю исследуемой культуры с плотной

питательной среды или 0,1 мл 18-часовой бульонной

культуры н после ч инкубации учитывают результаты

роста. При положительной реакции на редукцию

метиленового синего среда из голубой становится

кремового цвета, а при слабоположительной —

приобретает зеленоватое окрашивание.

2..Пробирки с лакмусовым молоком, средой Минкевича

засевают так же, как молоко с метиленовым синим,

суточной культурой с плотной или жидкой питательной

среды. Посевы инкубируют в термостате в течение 10

дней, ежедневно наблюдая за изменением цвета среды.

Редукция лакмуса проявляется полным

обесцвечиванием молока, имеющего розовато-сиреневый цвет до посева. В протоколе исследования

редукцию лакмуса обозначают буквой Р.

Среда Минкевича позволяет также выявлять кислото -

или щелочеобразование, выражающееся соответственно

в покраснении или посинении молочной среды.

Образование кислоты обозначается буквой К, щелочи

— буквой Щ.

Определение фермента каталазы. Некоторые виды

микроорганизмов, принадлежащие к группе аэробов, в

процессе дыхания образуют перекись водорода,

являющуюся клеточным ядом. Количество перекиси

водорода в культуре никогда не достигает высоких

концентраций, так как по мере образования перекись

расщепляется на воду и молекулярный кислород при

участии фермента каталазы. На поверхность микробной

культуры, выращенной на плотной питательной среде в

чашке Петри, наносят 1—2 мл 1% раствора перекиси

водорода так, чтобы она покрывала поверхность

культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в

слое нанесенной жидкости свидетельствует об

образовании кислорода в результате расщепления

перекиси водорода под действием каталазы. Подобный

результат в протоколе опыта отмечается знаком + как

положительный результат реакции на каталазу.

Дата добавления: 2015-12-15 | Просмотры: 813 | Нарушение авторских прав