АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение нуклеотидных последовательностей в геномах.

• С начала 20 века основные силы генетиков были сосредоточены на идентификации и картировании генов различных организмов. Для этого проводили поиск спонтанных мутаций или мутаций, возникших в результате физических или химических воздействий. Однако процесс получения мутаций довольно долгий и трудоемкий. Кроме того, возникшие мутации часто приводят к гибели организма, и это делает невозможным картирование мутантного гена.

• В последние десятилетия генетика сделала мощный рывок, перейдя от классических подходов мутагенеза и картирования к методам рекомбинантных ДНК. Для этого были созданы коллекции генных клонов – геномные библиотеки. Анализируя перекрывающиеся области последовательностей ДНК из различных клонов, генетики начали определять последовательность всех генов в геномах некоторых видов. Это направление получило название геномики.

• Анализ геномов представляет собой крупномасштабное исследование, требующее координированной работы многих лабораторий. Самый большой и широкоизвестный проект «Геном человека» (TheHumanGenomeProject) был инициирован в 1988 году Национальным Институтом Здоровья, США. В ходе запланированных работ проанализированы геномы человека (H. sapiens), бактерий (E. coli), дрожжей (S. cerevisiae), круглых червей (S. elegans), плодовой мушки (D. melanogaster) и мыши (M. musculus).

Первым разработанным методом определения нуклеотидных последовательностей в генах, составляющих геном был метод «клон за клоном». На первом этапе создаются геномные (хромосомные) библиотеки фрагментов, которые покрывают всю геномную ДНК организма (геномные клоны). Извлеченные из библиотек клоны анализируют, чтобы создать генетические и физические карты на основе наследования генетических маркеров (RFLPs, STSs) в гетерозиготных семьях. После этого в клонах ищут перекрывающиеся друг с другом последовательности. Таким образом, перекрывают всю хромосому.

На последнем этапе определяют нуклеотидную последовательность каждого клона, и, связывая их вместе, составляют последовательность ДНК всей хромосомы (генома). Основные этапы определения нуклеотидных последовательностей генома методом «клон за клоном» представлены на рис.1

• При использовании второго метода, названного методом дробовика или «шот-ган» (shotgun) клоны из геномных библиотек отбираются случайным образом. В отобранных клонах проводят определение последовательности нуклеотидов на основе секвенирования ДНК фрагментов с обоих концов. Аналогичным образом поступают до тех пор, пока все клоны библиотеки не будут проанализированы. Специально разработанные компьютерные программы позволяют проанализировать перекрывающиеся ДНК-последовательности клонов и связать их вместе. Таким образом, удается получить информацию о последовательности генома (хромосомы) в целом. Этот метод, разработанный К. Вентором в Институте исследования генома, был использован для определения последовательности генома Haemophilusinfluenzae в 1995 г. После усовершенствования метода Вентор организовал компанию Celera, чтобы определять последовательности геномов эукариот, включая человека.

• Следует подчеркнуть, что для исключения ошибок в нуклеотидной последовательности, составляющей геном, работы по секвенированию ДНК проводятся многократно. Так применяя метод дробовика при исследовании генома бактерии Pseudomonasaeriginoza (6,3х10⁶ н.п.) ученые определяли последовательность нуклеотидов 7 раз. Но даже после этого в результате компьютерной обработки данных было выявлено 1604 участка ДНК, для которых были нужны дополнительные исследования. На заключительном этапе полученные методом «шот-ган» данные по двум участкам генома длиной 82 тыс. н.п. сравнили с данными, полученными стандартным методом и результаты полностью совпали.

• В частном проекте компании CeleraGenomics для определения последовательности ДНК человека (3,2 х10⁹ н.п.), используя метод дробовика, последовательность генома была перекрыта 35 раз. И хотя в черновом варианте расшифровка генома человека завершена, необходимо еще провести коррекцию ошибок, заполнение пробелов размером 150 Mb, а также расшифровку 15% генома гетерохроматиновых районов.

Дата добавления: 2015-10-20 | Просмотры: 560 | Нарушение авторских прав