АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Выявление антигена и обнаружение специфических антител в РИД (на примере ротавирусной инфекции)

Принцип двойной радиальной иммунодиффузии основан на взаимодействии растворов антигенов и антител, помещенных в интактный гель, диффундирующих навстречу друг другу и (в случает их соответствия) образования специфического преципитата в местах встречи реагентов.

Реакция иммунодиффузии используется для диагностки инфекционного ринотрахеита, вирусной диаери, аденовирусной инфекции, ротавирусной инфекции.

Материл: В качестве исследуемого материала при диагностике ротавирусной инфекции используются пробы фекалий больных телят, соскобы и содержимое тонкого кишечника животных, павших с выраженной патологией желудочно-кишечного тракта, пробы сыворотки крови животных-реконвалесцентов, а также молозиво и молоко коров-матерей больных телят. Пробы фекалий или содержимое кишечника в 25—50%-ной концентрации промораживают при минус 20° С в течение 18—20 часов, оттаивают и осветляют центрифугированием в течение 20 мин при 4000 об/мин. Супернатант используют в качестве испытуемого антигена.

Предварительно необходимо приготовить боратный буфер по прописи: натрия гидроокиси (NаОН) - 2,0 г., кислота борная (Н₃ВО₃) - 9,0., натрий хлористый (NаСl) - 70,0 г, мертиолят (тиомерсал) - 0,05 г, вода дистиллированная - до 1 литра.

При приготовлении агарового геля к 100 мл боратного буфера на гипертоническом растворе натрия хлорида добавляют 0,7 г. агара “Дифко”. Флакон помещают в водяную баню с кипящей водой и выдерживают до полного расплавления агара (30—45 мин.).

Расплавленный агар вносят в чашки Петри, расположенные на строго горизонтальной поверхности в количестве 15 мл и оставляют их до полного застывания агара. Затем в агаре при помощи пробойника нарезают лунки диаметром 7 мм, расположенные на расстоянии 4 мм друг от друга. Агаровые пробки удаляют и, если в лунках накапливается влага, ее отсасывают перед внесением реагентов.

При необходимости индикации антигена в вируссодержащем материале в центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в первую и четвертую вносят специфический ротавирусный антиген, а остальные заполняют исследуемым материалом. В качестве контроля параллельно испытуемый материал исследуют с отрицательной (контрольной) сывороткой.

Для обнаружения антител - в центральную лунку вносят специфический ротавирусный антиген, в первую и четвертую - специфическую сыворотку, в остальные - испытуемые сыворотки. Параллельно испытуемые сыворотки исследуют с контрольным отрицательным антигеном.

Компоненты следует вносить в лунки с таким расчетом, чтобы мениск был вогнутый и жидкость не растекалась по поверхности агара.

После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру на 24—72 часа при комнатной температуре.

Реакцию считают положительной при наличии линии преципитации между лунками со специфической сывороткой и испытуемым антигеном, которая плавно переходит в контрольную линию между специфической сывороткой и положительным ротавирусным антигеном.

Дата добавления: 2015-11-25 | Просмотры: 404 | Нарушение авторских прав