АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Методы постановки реакции гемагглютинации и торможения гемагглютинации (на примере обнаружения коронавирусных антигенов и выявления противокоронавирусных антител)

Реакция гемагглютинации основана на принципе агглютинации эритроцитов различных видов животных вирусами, обладающими гемагглютинирующими свойствами.

При диагностике пневмоэнтеритов телят реакция гемагглютинации применяется для обнаружения вирусов, обладающих гемагглютинирующими свойствами, - вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, адено-, рота- и коронавирусов.

Компоненты реакций:

Р а с т в о р А л ь с е в е р а, используется для консервирования крови и состоящий из: глюкоза 24,6 г, натрий лимоннокислый 9,6 г, натрий хлористый 5,10 г, вода дистиллированная до 1200 мл. Его стерилизуют в водяной бане по 35 минут в течение трех дней.

Ф о с ф а т н о - б у ф е р н ы й и з о т о н и ч е с к и й р а с т в о р:

раствор А = Nа ₂НРО₄ х 2Н₂О - 53,72 г на 1 л дист. воды

раствор Б= КН₂ РО₄ - 20,42 г на 1 л дист. воды

раствор В= NаСI - 8,5 г на 1 л дист. воды

Для приготовления ФБР с рН 7,2 смешивают 430 мл раствора А, 119 мл раствора Б и 500 мл раствора В.

С у с п е н з и я э р и т р о ц и т о в м ы ш е й и л и к р ы с. Кровь берут путем тотального обескровливания животного в раствор Альсевера, центрифугирют в течение 10 минут при 2000 об/мин. Осадок эритроцитов трижды отмывают в ФБР и из отмытых эритроцитов готовят на ФБР 0,5% -ную суспезию.

К о р о н а в и р у с н ы й а н т и г е н, полученный из культурной вируссодержащей жидкости, обладающий гемагглютинирующими свойствами.

С п е ц и ф и ч е с к а я а н т и к о р о н а в и р у с н а я с ы в о р о т- к а, содержащая антитела к коронавирусу, получена путем гипериммунизации телят.

И с п ы т у е м ы е а н т и г е н ы — 25—50%-ная суспензия фекалий или кусочки кишечника, измельченные ножницами и растертые в ступке с песком.

Такую суспензию осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин, вносят пенициллин и стрептомицин из расчета 2000 ед/мл и в дальнейшем используют для постановки РГА и РТГА.

И с с л е д у е м ы е с ы в о р о т к и к р о в и. С целью освобождения их от ингибиторов, проводят инактивацию при 60°С в течение 30 мин, затем обрабатывают каолином, для чего к 0,5 мл сыворотки добавляют 0,25 мл 25%- ного каолина, выдерживают 30 мин при 37°С и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. В дальнейшем сыворотку обрабатывают эритроцитами мышей (крыс). Для этого в обработанную каолином сыворотку добавляют 0,25 мл 10%-ной суспензии эритроцитов и после часовой экспозиции при комнатной температуре освобождаются от эритроцитов путем центрифугирования при 1500—2000 об/мин в течение 15 мин. Стартовое разведение сыворотки 1:2.

Техника постановки РГА. С целью выявления коронавирусного антигена в пробах фекалий и кишечника проводят постановку реакции гемагглютинации микрометодом.

Используя микроплашки, в каждую лунку вносят по одной капле (0,025 мл) ФБР. Затем в каждую первую лунку вносят по одной капле исследуемого вируссодержащего материала и готовят последовательные двойные разведения. Для этого после 3-кратного пипетирования из первой лунки одну каплю переносят во вторую лунку и т.д. Из последней одну каплю удаляют в дезраствор. В дальнейшем во все лунки вносят по одной капле 0,5%-ной суспензии эритроцитов. При этом обязательным является контроль на возможность спонтанной агглютинации.

Плашки осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 60 мин. Учет результатов реакции производят через час после добавления суспензии эритроцитов, а затем оставляют при 4°С на 16—18 часов и повторно просматривают плашки. За агглютинирующий титр вируса принимают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не менее чем на 2+.

Диагностическим показателем РГА считают разведение 1:8 и более для подтверждения специфичности РГА и доказательства принадлежности гемагглютининов коронавирусу проводят постановку РТГА со специфической сывороткой.

Техника постановки РТГА. Проведение РТГА включает следующие этапы:

-определение рабочей дозы вирусного диагностикума; постановка основного опыта.

На первом этапе титруется вирусный диагностикум в РГА по методике, описанной выше. Определяется одна гемагглютинирующая единица (1 ГАЕ), составляющая то наибольшее разведение, при котором четко выражена агглютинация эритроцитов не менее чем на 2+. Для основного опыта используется 4 ГАЕ. Для этого показатель титра в 1 ГАЕ делят на 4. Так, если 1 ГАЕ составила титр 1:256, то рабочее разведение для РТГА будет равно 1:64. Достоверность расчетов и подбора рабочей дозы вируса (4 ГАЕ) определяют постановкой РГА.

В процессе проведения основного опыта РТГА, используя ФБР готовят последовательные двойные разведения исследуемых проб сыворотки крови, которые ранее были освобождены от ингибиторов и изогемагглютининов. Для этого в каждую лунку микроплашки вносят по 1 капле ФБР, а затем в каждую первую лунку — по 1 капле исследуемой сыворотки крови. После 3-кратного пипетирования из первой лунки 1 каплю переносят во вторую и т.д. Из последней лунки 1 каплю удаляют в дезраствор. В дальнейшем во все лунки вносят по 1 капле вирусного диагностикума, содержащего 4 ГАЕ.

Плашки осторожно, но тщательно встряхивают и после часового контакта сыворотки с атигеном в каждую лунку добавляют по 2 капли 0,5%-ной взвеси эритроцитов, снова осторожно встряхивают плашки и оставляют их при комнатной температуре в течение часа, а если необходимо, дополнительно выдерживают при 4°С в течение 16—18 часов. Основанием для проведения учета результатов реакции считается полное оседание эритроцитов в контролях:

контроль рабочей дозы вируса (4 ГАЕ); контроль эритроцитов на самоагглютинацию; контроль испытуемой сыворотки; контроль 4 ГАЕ с нормальной сывороткой; контроль 4 ГАЕ со специфической сывороткой.

Диагностическим титром, когда сыворотка считается положительной является разведение ее 1:32 и выше, где установлено торможение агглютинации эритроцитов не менее чем 2+.

Анализируя эффективность при использовании РГА и РТГА в диагностике коронавирусного энтерита, уместно напомнить о том, что указанные тесты могут быть с успехом применены и для диагностики ротавирусной инфекции по описанным выше методикам, но при использовании эритроцитов морской свинки или нулевой группы человека.

При экспресс-изучении эпизоотической ситуации по отдельному хозяйству следует провести исследование проб сыворотки крови больных (не мене 10% животных) и клинически здоровых новорожденных телят, подобранных по принципу аналогов. В этом случае принимают во внимание тот факт, что телята должны быть получены от неиммунных коров, при наличии характерных симптомов болезни и разности в титрах антител не менее чем в 3—4 раза между указанными группами животных, можно решить вопрос по диагностике болезни.

Ретроспективная диагностика предусматривает выявление прироста титра специфических антител в парных пробах сыворотки крови с помощью РТГА, РН, ИФА.

Диагноз считают установленным в одном из следующих случаев:

-при выявлении вируса, выделенного из исходного материала в культуре клеток, вызывающего специфический ЦПЭ с последующей иден- тификацией в РН, РТГА и ИФА;

-при индикации вирионов с характерной морфологией в исследуемом материале методом иммуноэлектронной микроскопии;

-при обнаружении коронавирусных антигенов в пробах фекалий или соскобов со слизистой оболочки в РИФ, ИФА и РИД при наличии характерных клинических и патологоанатомических показателей, с учетом эпизоотической обстановки;

-при 3—4 кратном увеличении титра антител во второй пробе сыворотки крови в сравнении с первой при ретроспективной диагностике.

В процессе проведения дифференциальной диагностики необходимо исключить ротавирусную и аденовирусную инфекции, сальмонеллез, стрептококкоз, анаэробную энтеротоксемию, криптоспоридиоз, а также незаразные болезни, сопровождающиеся поражением желудочно-кишечного тракта.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ

Своевременная и точная диагностика является той основой, на которой зиждется эффективная система терапии и профилактики паразитарных болезней животных. Основными методами диагностики в ветеринарной паразитологии являются лабораторные методы исследований, многие из которых предполагают обнаружение и дифференциацию возбудителя болезни, изучение его свойств и чувствительности к тем или иным препаратам.

Существуют прижизненные и посмертные методы диагностики паразитозов.

При различных паразитарных болезнях применяют разные методы диагностики, основанные на современных научных достижениях и накопленном опыте практических специалистов. Определение возбудителя может проводиться или прямым путем (при осмотре животных, путем микроскопирования мазков крови, просмотра под микроскопом проб фекалий, соскобов с кожи и т. д.), или косвенным путем (при аллергической диагностике с известным антигеном и др.). При всех известных способах диагностики паразитарных болезней ставится совершенно определенная цель — установить возбудителя и определить степень пораженности им животного.

В настоящее время при постановке диагноза на паразитозы важным является выяснить не только экстенс-, но и интенсинвазированность животных паразитами. Не менее важным является также определение состава паразитоценоза, в том числе гельминтов, клещей, насекомых, простейших и других организмов.

Известно, что человек, животные и окружающая их среда экологически взаимосвязаны. Поэтому происходит циркуляция возбудителей паразитарных болезней в природе и обществе. Вот почему важным является изучение зараженности паразитами человека и животных (особенно зоонозами), распространения возбудителей этих болезней в окружающей среде.

В условиях индустриализации и урбанизации нашей планеты важно изучить закономерности распространения паразитозов, выяснить пути сохранения организмов в постоянно меняющихся условиях среды.

Все это определяет методологические подходы к диагностике паразитарных болезней, в связи с чем, в последнее время все больше внимания уделяется применению современных методов и средств диагностики: электронной микроскопии, внедрению иммуноферментных методов исследований, использованию радиодиагностических наборов и др.

ДИАГНОСТИКА ПРОТОЗООЗОВ ЖИВОТНЫХ

Перед обследованием животных с целью обнаружения в их организме патогенных простейших необходимо провести работы по подготовке материалов.

Для этой цели готовят предметные и покровные стекла. Лучше использовать новые, не бывшие в употреблении, которые тщательно моют в теплой воде с мылом. После этого их промывают чистой водой, насухо вытирают и помещают в банку с притертой пробкой, в которую перед этим наливают абсолютный спирт или смесь равных объемов спирта и эфира (смесь Никифорова). Перед употреблением стекла насухо вытирают чистой салфеткой.

В полевых условиях для обезжиривания предметных стекол применяют следующий способ. Сначала их протирают чистой салфеткой и после этого хорошо покрывают хозяйственным мылом. Затем стекла повторно протирают сухой чистой салфеткой или полотенцем до полного удаления мыла.

Взятие крови у животных. Пробы крови у животных берут в тех случаях, когда необходимо заразить ею подопытных животных, для серологического исследования или для приготовления препаратов.

Для биопробы или серологических исследований кровь у крупного рогатого скота, лошадей и мелких жвачных берут из яремной вены, у птиц — из подкрыльцовой вены. Для обнаружения простейших кровь у млекопитающих берут из сосудов кончика уха, у птиц — из гребня или подкрыльцовой вены.

Приготовление мазков крови и пунктата органов. На чистое предметное стекло наносят первую каплю крови, взятой у животного (в ней находится больше паразитов) и специально отшлифованным стеклом делают мазок. Во избежание загрязнения пылевыми частицами воздуха предметное стекло поворачивают сразу же мазком книзу. Через 10—15 с инъекционной иглой или карандашом ставят на предметном стекле номер или кличку животного и дату приготовления препарата. После этого мазок просушивают 10—12 мин.

Если препараты готовятся в зимнее время, предметные стекла перед нанесением на них капли крови следует подогревать до температуры 20—25 °С.

Для приготовления препарата толстой капли кровь наносят на предметное стекло, размазывают круговым движением толстым круглым слоем и помещают в термостат на 5—10 мин для высыхания. После этого на препарат наносят несколько капель дистиллированной воды (для гемолиза эритроцитов), осторожно сливают ее после того как препарат станет прозрачным. Препарат подсушивают и красят. Для фиксации мазков крови применяют различные химические вещества, среди которых — метиловый спирт, этиловый спирт, денатурированный спирт, реже применяют смесь Никифорова и др.

Для этой же цели можно применять и жидкость Завесина и Белокура (1950). Для ее получения необходимо на физиологическом растворе (рН 6,8—7,0) приготовить 4%-ный раствор чистой карболовой кислоты. Готовый раствор фильтруют и хранят в темном месте в течение 10—15 дней в банке из темного стекла с притертой пробкой. Длительность фиксации мазков крови — 5с. Мазок вынимают из фиксирующей жидкости пинцетом, ставят вертикально на полоску фильтровальной бумаги на 8—10 мин для сушки и потом окрашивают.

Окраска простейших. Осуществляется различными методами, однако наиболее приемлемыми являются следующие:

Окраска мазков крови и пунктатов из органов по Романовскому-Гимза. Поступающие в ветеринарные лаборатории основные растворы краски Романовского-Гимза не всегда бывают одинаковыми по своим красящим свойствам. Поэтому необходимо предварительно подбирать наилучшие сочетания количества вещества и сроков окрашивания при определенном объеме и рН воды.

Обычно для окрашивания препаратов основной раствор краски разбавляют из расчета 1 капля на 1 мл воды. Но иногда на 1 мл воды приходится расходовать 2—3 капли краски, но не более, так как в более концентрированных растворах она выпадает в осадок. Рабочий раствор готовится перед употреблением. Для получения хорошего качества рабочего раствора краски маточный раствор необходимо разводить дистиллированной водой (рН 7,0-7,2). В крайнем случае можно использовать прокипяченную профильтрованную проточную воду указанной реакции. Для разведения краски необходимо пользоваться одной и той же чистой посудой из стекла нейтральной реакции. При приготовлении рабочего раствора в сосуд с водой необходимо вносить по каплям требуемое количество краски и постоянно слегка помешивать, так как большое количество маточного раствора и грубое встряхивание могут привести к выпадению осадка. Маточный раствор краски хранят в темном сухом месте с постоянной температурой (20—22 °С). Если красящая способность раствора снизилась, ее необходимо подогреть в водяной бане до 60 °С в течение 15 мин.

Для окрашивания препаратов их помещают на дно чашки Петри мазком вниз на тонкие плоские стекла, чтобы расстояние между дном чашки и предметным стеклом составляло 0,3—0,5 см. После этого под предметные стекла осторожно подслаивают свежеприготовленную краску. Продолжительность окраски может быть от 15—20 мин до часа, но в среднем 30—40 мин. Свежие препараты окрашиваются быстрее и лучше. Нефиксированные мазки крови можно сохранять не более 1—2 недель, так как через месяц они теряют способность окрашиваться. Фиксированные препараты (мазки крови, пунктаты органов и т. д.) можно сохранять до окраски 1—2 мес. Перед применением краску нужно подогреть в термостате до 37 °С. После окраски мазки крови промывают дистиллированной водой и ставят в вертикальном положении на полоски фильтровальной бумаги. Хорошо промытое предметное стекло с мазком крови не должно оставлять на фильтровальной бумаге следов краски.

При хорошей окраске препараты имеют розово-фиолетовый цвет, эритроциты в тонких мазках крови окрашиваются в красный или розовый цвет, протоплазма паразитов и лейкоциты — в синий, ядра простейших и зернистость эозинофилов — в красный, а ядра лейкоцитов — в фиолетовый цвет. В перекрашенных мазках крови эритроциты имеют синий цвет и в них трудно различать паразитов.

Если мазки крови перекрашены, их погружают на 1—2 с в 80°-ный этиловый спирт, слегка подкисленный уксусной кислотой, или в подкисленную дистиллированную воду (на 100 мл спирта или воды добавляют 2 капли ледяной уксусной кислоты). После того как предметные стекла с мазками вынут из подкисленной воды или спирта, их немедленно промывают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют или оставляют на хранение.

Ускоренная окраска мазков крови по Романовскому-Гимза. Нефиксированный мазок помещают в чашку Петри и подслаивают смесь из неразведенной краски Романовского-Гимза и ацетона в равных количествах. Через минуту в чашку Петри в расчете на каждый миллилитр смеси краски и ацетона добавляют 10 мл дистиллированной воды и смешивают их легким покачиванием чашки. Через 10 мин мазок промывают водой, сушат и микроскопируют.

Окраска мазков крови по Филипсону. Одну часть рабочего раствора краски Романовского-Гимза смешивают с тремя частями этилового спирта и 1 мл приготовленной смеси наносят на нефиксированный мазок крови. Через 1—1,5 мин к краске добавляют 1 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на 30 мин для окрашивания. После этого краску смывают водой, мазок просушивают и микроскопируют.

Окраска мазков крови по Мансону. Берут 5 г буры и 2 г метиленового синего и растворяют их в дистиллированной воде (80 °С), выдерживают 2 ч в кипящей водяной бане, охлаждают и фильтруют. После этого для созревания помещают в термостат при температуре 37 °С. Для приготовления рабочего раствора берут каплю краски на 3—4 мл воды. Окраску мазков крови проводят в течение 1 мин. Затем препарат высушивают и микроскопируют. Окрашенный препарат имеет матово-зеленый цвет, эритроциты окрашиваются в светло- или сине-зеленый цвет, ядра лейкоцитов — в темно-синий, протоплазма — в светло-зеленый цвет. Паразиты имеют темно-синее ядро и светло-синюю протоплазму.

Окраска мазков крови по Ш. Д. Мошковскому. Готовят основной раствор метиленовой сини: на 100 мл дистиллированной воды берут 1 г метиленовой сини и 2,5 г буры. Раствор кипятят, охлаждают и фильтруют. Фиксированный мазок крови помещают на 10—20 с в разбавленный дистиллированной водой (1: 10) основной раствор метиленовой сини. После этого мазок промывают водой, затем погружают на 5 с в 8—10%-ный раствор танина, повторно промывают, подсушивают и микроскопируют.

Окраска мазков крови по Нохту. Готовят растворы: азур II разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1000, аналогично готовят раствор эозина ВА. Краски хранят в склянках из оранжевого стекла в темном сухом месте. Перед окраской готовят рабочие растворы. Для этого в 4 мл дистиллированной воды (рН 7,0) разводят 2 мл 0,1 %-ного раствора эозина и к 4 мл воды добавляют 2 мл 0,1 %-ного раствора азура. Краски смешивают. Мазки крови помещают в чашку Петри, подслаивают краску и выдерживают 30—40 мин. После этого мазки подсушивают и микроскопируют.

Окраска мазков крови по Шуренковой и Межанской. Вначале готовят раствор А. Для этого берут 1 г метиленового синего и растворяют в 75 мл кипяченой воды; 1,5 г марганцово-кислого калия также растворяют в 75 мл кипяченой воды. Оба раствора сливают в колбу (вследствие этого образуется осадок), помещают ее в водяную баню и выдерживают при 100°С 40 мин, считая с начала кипения воды. После этого дают раствору остынуть и фильтруют.

Затем готовят раствор Б. Для этого берут 1 часть раствора А и добавляют 2 части подкисленной кипяченой воды (ее готовят путем добавления на 200 мл дистиллированной воды 15 капель разведенной соляной кислоты). При этом получают раствор № 1. После растворения в 200 мл кипяченой воды 0,2 г эозина водорастворимого получают раствор № 2.

При скоростном способе окрашивания фиксированный мазок погружают на 15—20 с в раствор № 2, прополаскивают водой и на 45 с погружают в раствор № 1, повторно промывают водой, подсушивают мазок на фильтровальной бумаге и микроскопируют.

Для массовой окраски мазков применяют длительный способ. Фиксированный мазок помещают на 5—10 мин в краску Б, разведенную 1: 10 дистиллированной водой. После этого мазки промывают водой и заливают на 15— 20 мин краской А, также разведенной 1: 10 водой. Мазки повторно промывают водой, подсушивают и микроскопируют. Обычно хорошо окрашенный мазок имеет сиреневый цвет. Ядра лейкоцитов окрашиваются в фиолетовый цвет, протоплазма простейших — в голубой, а ядро — в вишнево-красный цвет. Если мазки перекрашены эозином и имеют ярко-красную окраску, их на несколько секунд погружают в раствор № 1, слишком синие мазки погружают на несколько секунд в раствор № 2.

Окраска трихомонад: а) метод Романовского. Мазки фиксируют метиловым спиртом в течение 10 мин. После этого их окрашивают 45 мин краской Романовского-Гимза, разведенной 1: 15 нейтральной или слабощелочной дистиллированной водой; б) метод Шуренковой и Межанской. Мазки фиксируют в течение 10 мин метиловым спиртом. После этого их окрашивают 2 мин в растворе № 2, а затем в течение 1 мин — в растворе А; в) метод Милорадовича. Вначале готовят раствор № 1. Для этого 1 г основного фуксина смешивают с 10 мл 95°-ного этилового спирта и ставят в термостат при температуре 37 °С на 48 ч. После растворения фуксина к нему добавляют 100 мл 5%-ного раствора карболовой кислоты, смешивают и фильтруют. Полученный раствор разводят 1: 50 дистиллированной водой. Перед употреблением на каждый миллилитр рабочего раствора добавляют по капле насыщенного раствора танина.

Раствор № 2 получают путем смешивания равных объемов 1%-ного раствора ауранция и 0,5%-ного раствора эозина.

Оба раствора готовят на 2%-ной карболовой кислоте. После фиксации и ополаскивания мазка на него наносят раствор № 1. Через минуту его сливают и сразу же наносят раствор № 2. Через 20 с препарат прополаскивают водой, просушивают и микроскопируют.

Окраска толстых капель крови: а) метод Шуренковой и Межанской. При скоростном способе окраски препарат в течение 15—20 с несколько раз погружают в раствор А. После того как капля крови на предметном стекле окрасится из зеленого в прозрачно-голубой цвет, препарат промывают водой, погружают в раствор № 2 и сразу же ополаскивают, высушивают и микроскопируют.

Если проводят массовую окраску, тогда применяют длительный способ: на 10-15 мин заливают разведенной (1:10) водой краской А. Затем ее сливают, препарат промывают водой и покрывают на 1-2 мин краской № 2, также разведенной (1:10) водой. После этого препарат промывают водой, просушивают и микроскопируют;

б) метод Иоффе. Готовят краску: берут 4 мл 1%-ного раствора метиленовой сини, 1 мл 1%-ного раствора фуксина на 50%-ном этиловом спирте, сюда же добавляют 4 мл 1 %-ной уксусной кислоты и 40 мл дистиллированной воды.

На нефиксированный препарат наносят краску. Через 15 мин ее осторожно смывают водой, препарат подсушивают и микроскопируют. При этом методе окраски эритроциты растворяются.

Методы исследования патогенных простейших. Методы исследования простейших, изучение их морфологии и биологии, а также диагностика вызываемых ими болезней животных предполагают использование микроскопических, серологических, аллергических, культуральных и других исследований в ветеринарной протозоологии. В связи с тем, что все указанные методы исследований имеют свои достоинства и недостатки, только проведение комплексных исследований дает наиболее высокую эффективность при постановке диагноза на данное заболевание или следует провести дифференциальную диагностику.

Диагностика эймериозов

Для эффективной диагностики эймериозов необходимо правильно отобрать материал для исследований. Так как для эймерий характерным является видовая специфичность возбудителя и они имеют свои определенные места обитания в организме, важным является исследование определенных органов при постановке диагноза на эймериоз.

Для обнаружения ооцист эймерий исследуют фекалии животных, для выявления неполовозрелых форм шизогонии и гаметогонии исследуют кусочки пораженных органов.

Прижизненная диагностика эймериозов. Прижизненная диагностика предполагает обнаружение в фекалиях больных животных ооцист эймерий. Их обнаруживают путем исследования фекалий животных методом нативного мазка или флотационными методами.

Метод нативного мазка состоит в том, что на чистое предметное стекло помещают около 0,5 г фекалий и тщательно размешивают стеклянной палочкой с небольшим количеством смеси воды и глицерина в равных частях. После этого крупные частицы фекалий снимают пинцетом или препаровальной иглой, а оставшуюся массу покрывают стеклом и микроскопируют.

Флотационные методы являются более эффективными, чем метод нативного мазка. Для диагностики эймериозов применяются методы Г. А. Котельникова и В. М. Хренова (1974) с использованием растворов аммиачной или натриевой селитры, методы Фюллеборна, Дарлинга и др.

Культивирование эймерий проводится с целью изучения спорогонии у них. Для этого берут пробу фекалий, помещают в чашки Петри и смешивают их с мелкоистолоченным древесным углем и с 5%-ным раствором двухромово-кислого калия с целью предохранения фекалий от плесени. Чашки Петри с фекалиями помещают в теплое место и периодически перемешивают для лучшей аэрации. При необходимости пробы фекалий микроскопируют для определения сроков развития эймерий.

Посмертная диагностика эймериозов. Для исследования берут содержимое кишечника, соскоб слизистой оболочки кишки в местах с наибольшим поражением, кусочки пораженных паренхиматозных органов. Из отобранного материала готовят препараты (раздавленные капли, нативные мазки) для исследования живых эймерий, а также мазки или кляч-препараты для окраски паразитов.

Для обнаружения живых эймерий на различных стадиях берут кусочек содержимого из эймериозного узелка, помещают на предметное стекло в каплю физиологического раствора в смеси с белком куриного яйца. Содержимое узелка препаровальными иглами расчленяют на мелкие части, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Мерозоиты и шизонты хорошо заметны в затемненном поле зрения. При этом учитывают, что внедрившиеся в эпителиальную клетку спорозоиты имеют округлую форму с ядром в центре, а более зрелые макрогаметы – зернистость, они овальной формы и покрыты однослойной оболочкой, на одном из полюсов которой находится микропиле (табл.3-7).

Таблица 3. Эймерии крупного рогатого скота (по И. И. Вершинину, 1982)

Примечание. Таблица составлена по данным Р. А. Nyberg и D. М. Наmmоnd) (1965), L. Р. Реllerdy (1974), I. V. Еrnst, R. О. Stevens, С. Соореr (1971), S. Sоекаrdоnо, I. V. Егnst, G. V. Веns (1975).

Таблица 4. Основные виды эймерий овец (по И. И. Вершинину)

Таблица 5. Эймерии свиней (по И. И. Вершинину)

Таблица 6. Эймерии кроликов (по данным В. Л. Якимова, И. П. Орлова и Е. М. Хейсина)

Таблица 7. Эймерии кур и индеек (по данным С. К. Сванбаева, В. Н. Кошкиной и Н. П. Орлова)

* Паразитирует у индеек

Посмертная диагностика эймериоза может осуществляться также с помощью гистологического исследования кусочков пораженных органов (печень, почки и др.). Для этого их фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине, в жидкости Буэна или жидкости Карнуа.

Для приготовления жидкости Буэна берут 15 частей насыщенного раствора пикриновой кислоты, 5 частей нейтрального формалина и одну часть ледяной уксусной кислоты. В этой жидкости кусочки ткани фиксируют в течение 10-12 ч, а приготовленные мазки или кляч-препараты – 15-20 мин.

Жидкость Карнуа готовят из 60 частей абсолютного этилового спирта, 10 частей ледяной уксусной кислоты и 30 частей хлороформа. Кусочки ткани фиксируют 3—4 ч, мелкие препараты — 30—60 мин. После фиксации из кусочков органов делают препараты, окрашивают их и микроскопируют.

Диагностика криптоспоридиоза

Основным методом диагностики криптоспоридиоза является микроскопическое выявление возбудителя. Для этого применяют прижизненные и посмертные методы диагностики.

Прижизненная диагностика криптоспоридиоза молодняка сельскохозяйственных животных основана на выявлении этих паразитов в фекальных массах.

Приготовление препаратов из фекалий. На обезжиренное предметное стекло наносят несколько капель жидких фекалий больных животных (лучше с комочками слизи) и делают тонкий мазок. Препарат хорошо высушивают, после чего фиксируют спирт-эфиром или метанолом в течение 10 мин, высушивают и несколько раз проводят над пламенем спиртовки.

Для увеличения количества криптоспоридий в исследуемом материале можно применять различные методы обогащения. Одним из них является комбинированный метод центрифугирования с использованием флотационных растворов. В качестве последних можно применять растворы нитрата аммония с плотностью 1,3 (1500 г вещества на 1 л воды), серно-кислого цинка с плотностью 1,24 (400 г соли на 1 л воды), нитрата натрия с плотностью 1,38—1,40 (1000 г вещества на 1 л воды), сульфата магния с плотностью 1,26 (920 г соли на 1 л воды) и др.

Пробу фекалий массой 3 г помещают в стаканчик и, постоянно помешивая, приливают 50 мл воды. Взвесь фильтруют в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 1,5—2 мин со скоростью 3000 об/мин. После этого надосадочную жидкость сливают, в пробирку наливают один из флотационных растворов, стеклянной палочкой размешивают осадок и повторно центрифугируют. Затем проволочной петлей снимают верхний слой жидкости с центрифужной пробирки, переносят капли на хорошо обезжиренное стекло, предварительно покрытое плазмой или альбумином, и делают мазок. Мазки хорошо высушивают, фиксируют и окрашивают.

Окраска препаратов по Циль-Нильсену. Вначале готовят карболовый фуксин. Для этого берут основного фуксина 2 г, этилового спирта (96°) 12 мл, карболовой кислоты 5 г и дистиллированной воды до 100 мл.

Приготовленную краску наносят на препарат и выдерживают без подогревания 25—30 мин. После этого мазок промывают водой, наносят на препарат 8—10%-ный раствор серной кислоты и выдерживают 40—60 с.

Повторно промывают препарат водой и в течение 3— 5 мин окрашивают его 5%-ным раствором малахитового зеленого в 10%-ном этаноле. Препарат промывают водопроводной водой, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы.

В результате окрашивания ооцисты криптоспоридий диаметром 4—5 мкм имеют ярко-красный цвет, а микрофлора мазка окрашивается в зеленый. Приготовленные и окрашенные по этому способу препараты хорошо сохраняются.

Окраска препаратов по Романовскому-Гимза. На фиксированный препарат наносят 10%-ный раствор краски Романовского-Гимза. Через 30 мин ее смывают водой, препарат высушивают и микроскопируют. При этом ооцисты криптоспоридий окрашиваются слабо. Внутри их иногда можно обнаружить удлиненные и изогнутые спорозоиты, располагающиеся по периферии ооцист.

Окраска препаратов по Кестеру. Готовят раствор сафранина. Для этого к 2 частям насыщенного водного раствора сафранина добавляют 5 частей 5,6%-ного раствора калийной щелочи.

На фиксированный мазок наносят приготовленную краску сафранина. Через 5 мин препарат промывают водой и покрывают на 10 с 0,1%-ным раствором серной кислоты. Препарат повторно промывают водой и докрашивают в течение 12 с 5%-ным раствором малахитового зеленого, промывают водой, высушивают и исследуют при помощи микроскопа с иммерсионной системой.

Метод Вильсона. В центрифужную пробирку набирают 1 мл фекалий, добавляют 2 мл 2,5%-ного раствора бихромата калия и 5 мл раствора сахарозы (1,26 г на 1 мл) в дистиллированной воде. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 800 об/мин. Из верхнего мениска содержимого пробирки петлей снимают несколько капель раствора и переносят их на предметное стекло, покрывают их стеклом и микроскопируют при увеличении X 400. В поле зрения микроскопа—ооцисты крип-тоспоридий светлые на темном фоне остальных структур.

Выявление криптоспоридий с помощью флуоресцентного микроскопа. Мазки фекалий обрабатывают раствором аурамина с карболовой кислотой. После этого их промывают водой и окрашивают в течение 8—10 мин раствором карболового фуксина. Повторно препарат промывают водой, высушивают и исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа с иммерсионной системой. При этом обнаруживают ооцисты криптоспоридий в виде ярко флуоресцирующих дисков на темно-красном фоне.

Для посмертной диагностики криптоспоридиоза берут содержимое тощей или подвздошной кишки или делают соскобы со слизистых оболочек их. Материал наносят на обезжиренное стекло, делают мазок, высушивают его, фиксируют и красят по описанным выше методам. Можно также взять 1 г содержимого подвздошной или тощей кишки и исследовать его по описанному выше методу Вильсона.

Диагностика токсоплазмоза

Токсоплазмоз диагностируют с помощью различных методов исследований, включающих эпизоотологические, клинические и лабораторные. Эпизоотологическими исследованиями обнаруживают животных с неясной этиологией заболевания: появление мертворожденных плодов, абортов, всевозможных уродств и т. д. Токсоплазмоз клинически может проявляться в виде параличей, парезов, конъюнктивитов, пневмоний, лихорадки, расстройства работы сердечно-сосудистой системы и органов желудочно-кишечного тракта.

Лабораторные исследования включают в себя микроскопию мазков или гистологических срезов различных органов и тканей: головного мозга, печени, почек, селезенки, легких, лимфатических узлов, сердца. Токсоплазмоз можно обнаружить также в ликворе, плодовых водах, моче, фекалиях.

Для диагностики токсоплазмоза ставят также биопробу на лабораторных животных, проводят иммуносерологическпе и копроскопические исследования фекалий кошек с целью обнаружения ооцист.

Из указанных выше органов не позже чем через 2-3 ч после гибели животных готовят мазки-отпечатки, фиксируют их метиловым спиртом (можно этиловым спиртом или смесью Никифорова) в течение 8-10 мин, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 45 мин. Препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Наиболее типичной формой внеклеточных токсоплазм является дугообразная или полулунная форма паразита, у которого один конец удлиненный и острый, второй — широкий и округлый. Тканевые токсоплазмы обычно округлой или овальной формы, реже они имеют форму полумесяца. Размеры их достигают 4-7х2-4 мкм.

Из экссудатов, плодовых вод, ликвора и других жидкостей путем центрифугирования (2000 об/мин, 20 мин) можно выделить живых токсоплазм. Их берут из осадка центрифужной пробирки и исследуют в висячей или раздавленной капле под обычным увеличением микроскопа или при помощи иммерсионной системы. Живые токсоплазмы видны при затемненном поле зрения микроскопа, они совершают колебательные, волнообразные или скользящие движения, для чего необходимо поддерживать температуру 37-40 °С.

Выявление ооцист токсоплазм в фекалиях кошек проводится копроскопическим методом с применением центрифугирования и флотационных растворов. Для этого берут 1 г фекалий, помещают в фарфоровую ступку, добавляют 8-10 мл воды, 3 капли 1%-ного раствора карболовой кислоты и хорошо растирают пестиком. Смесь из ступки фильтруют через металлическое или капроновое ситечко в центрифужную пробирку и центрифугируют при скорости 2500 об/мин в течение 10 мин. После этого надосадочную жидкость сливают, к осадку приливают раствор аммиачной селитры с плотностью 1,3 (или другого флотационного раствора с плотностью более 1,15), стеклянной палочкой размешивают осадок с раствором соли и повторно центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 5 мин.

Затем с поверхностного слоя жидкости центрифужной пробирки металлической петлей снимают 5—6 капель, наносят их на обезжиренное предметное стекло и микроскопируют.

Биопроба также является одним из основных методов диагностики токсоплазмоза. Для ее проведения берут навеску в 1 г кусочков головного мозга, печени, селезенки, лимфатических узлов или органов абортированного плода, помещают в стерильную фарфоровую ступку, добавляют туда 3 мл физиологического раствора и тщательно растирают. Полученную суспензию вводят внут-рибрюшинно по 0,5 мл 4—5 белым мышам. При наличии токсоплазм в исходном материале у них через 5—7 дней после введения суспензии появляется тяжелая форма болезни. При этом в брюшной полости мышей образуется до 3 мл транссудата, содержащего большое количество эндозоитов. Для обнаружения токсоплазм берут транссудат из брюшной полости, готовят мазки, из головного мозга делают мазки-отпечатки. Приготовленные препараты фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза, затем просушивают и микроскопируют на наличие эндозоитов с использованием иммерсионной системы, на наличие цист препараты просматривают при увеличении микроскопа 7х20.

Иммуносерологическую диагностику токсоплазмоза проводят с применением токсоплазменного антигена.

Диагностика саркоцистозов

Она проводится на основании эпизоотологических, клинических, серологических и микроскопических исследований, по данным патоморфологических вскрытий.

Компрессорный метод выявления саркоцист. Дляэтой цели берут пробы мышц различных органов — пищевода, диафрагмы, сердца, скелетных мышц и из каждой пробы по ходу мышечных волокон вырезают по 4 среза величиной с овсяное зерно (И. И. Вершинин, 1982). Срезы помещают на стекло компрессориума, накрывают вторым стеклом и сдавливают с помощью винтов. После этого микроскопируют при увеличении 7х8.

Препараты можно подкрашивать с помощью раствора краски Романовского-Гимза (2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 1 ч. После этого препараты обесцвечивают нашатырным спиртом.

Окрашивать препараты можно и по другой методике. Для этого вначале готовят краску: к 30 мл 10%-ного раствора метиленовой сини добавляют 30 мл 0,01%-ного раствора калийной щелочи и полученную смесь разбавляют поровну дистиллированной водой. Полученной краской можно окрашивать препараты в течение 10 мин с последующим обесцвечиванием 25%-ным раствором аммиака (Г. В. Кононенко, 1968).

Метод А. Г. Какурина (1976, 1978) окраски мышечных срезов состоит в том, что автор на препарат предлагает наносить в течение 10 мин 2-3 капли смеси краски, которую готовят из равных частей 0,5%-ного водного раствора метиленовой сини и ледяной уксусной кислоты. После окраски проводят обесцвечивание срезов 25%-ным раствором нашатырного спирта. Препарат промывают водой и микроскопируют. В препарате саркоцисты выглядят в виде темно-синих образований на голубом фоне мышечной ткани. Существуют и другие методы окрашивания срезов для диагностики саркоцист.

Иногда бывает необходимо провести дифференциацию различных видов у одного и того же промежуточного хозяина. Для этого можно применить метод выделения саркоцист по М. Еrbег (1977). Суть его состоит в том, что берут пробу мышц массой 10 г, тщательно измельчают (до 2—3 мм длины), после чего ее помещают в колбу Эрленмейера и приливают туда 50 мл физиологического раствора. Туда же добавляют 8—10 стеклянных бусинок и взбалтывают. Потом суспензию фильтруют через сито с отверстиями диаметром 600—700 мкм в пробирку и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, а осадок пробирки наносят на предметное стекло и микроскопируют при увеличениях Х160 или Х640.

Для обнаружения мерозоитов наиболее удобным является метод М. Коzаr (1971). Берут 2—5 г мышечной ткани, помещают в фарфоровую ступку, добавляют 1— 2 мл физиологического раствора и тщательно растирают. Затем берут каплю полученной суспензии, помещают ее на обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют при затемненном поле. Мерозои-ты видны в виде банановидных образований.

Для выявления трофозоитов саркоцист мышечной ткани О. В. Рыбалтовский (1971) предложил модифицированный метод переваривания мышц в желудочном соке. Для этого 2—3 г мышечной ткани хорошо измельчают, помещают в плоскодонную колбу и заливают 30 мл искусственного желудочного сока (3 г пепсина, 1 мл концентрированной соляной кислоты и 100 мл воды). Колбу помещают в термостат на 1 ч при температуре 38-40 °С. После этого содержимое колбы фильтруют в пробирки и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 3 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок помещают на предметные стекла, делают мазки, высушивают их и фиксируют метиловым спиртом. Затем красят 10 мин по Романовскому-Гимза и исследуют под иммерсионной системой микроскопа. Для этих же целей мышцы можно переваривать и трипсином (М. Еrbеr, 1977), а также использовать для выявления мерозоитов метод выдавливания мясного сока (А. А. Богуш, 1976).

Для прижизненной диагностики саркоцистоза плотоядных применяют методы центрифугирования с использованием флотационных растворов.

Для этого берут пробу фекалий массой 3 г, помещают ее в фарфоровую ступку, доливают в нее 25—30 мл воды и пестиком растирают содержимое. Затем полученную взвесь фильтруют в центрифужную пробирку, центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 3—4 мин. После этого осадок сливают, а к осадку добавляют флотационный раствор (с плотностью более 1,2) и повторно центрифугируют при тех же параметрах. Бактериологической петлей с верхней поверхности жидкости в пробирке снимают 5—6 капель, наносят их на обезжиренное предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют при увеличении Х280 и Х630. При этом в препаратах можно обнаружить спорулирован-

Таблица 8. Отличительные особенности саркоспоридий,

Дата добавления: 2015-11-25 | Просмотры: 724 | Нарушение авторских прав