| Фермент (пример)
| Среда для детекции
| Позитивная реакция
|
| САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
|
| Амилаза
| Крахмальный агар (агар с 0,2% крахмала) и раствор Люголя.
| При нанесении раствора йода на среду с 18 - 24 часовой культурой микроорганизмов, вокруг колоний с амилазной активностью образуется светлый неокрашенный ореол, в то время как другая среда приобретает сине-фиолетовый цвет из-за присутствия в ней крахмала.
|
| Карбо-гидразы
| Дифференциально-диагностические среды для энтеробактерий (Эндо, Левина, Плоскирева и др.); содержат лактозу, анилиновые красители.
| Лактозоположительные энтеробактерии (Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, K. pneumonia), образуют ярко окрашенные красные колонии,
лактозонегативные энтеробактерии (Salmonella, Shigella) - бледно-розовые или бесцветные колонии
|
| Полиуглеводные среды (Клиглера, Олькеницького и др.).. Среда Клиглера имеет малиново-красный цвет и содержит: 0,1% глюкозы, 1% лактозы, соли Fe 2 +, феноловый красный (индикатор рН).
| При разложении глюкозы желтеет столбик среды, при разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении углеводов с образованием CO2 в среде также появляются газовые пузырьки или разрыв столбца; при образовании H2S наблюдается почернение по ходу укола.
|
| Жидкие или полужидкие моноуглеводные среды Хисса; содержат один из углеводов, индикатор рН рН среды устанавливают 7,2 ± 0,2. Для выявления газообразования в жидкие среды вносят поплавок.
| При разложении углеводов образуются кислые продукты, снижающие рН среды, в результате чего индикатор рН меняет цвет. Газообразование в жидких средах приводит к накоплению газа в поплавке, в полужидких - появление разрывов или газовых пузырьков в среде.
|
| Продукция ацетил-метил-карбинола
| Определяют с помощью реакции Фогес-Проскауэра, используют 10% КОН или 20% КОН.
| После добавления в культуру равного объема 10% или 20% КОН и инкубации 4-24 часов при 37 ° С в случае образования ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет с желтым оттенком в случае образования ацетона и 2,3-бутиленгликоля окраска не меняется.
|
| ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
|
| Протеазы и пептидазы
| 5% обезжиренное молоко.
| Происходит свертывание с образованием сгустков казеина и пептонизация с лизисом казеина, при которой молоко становится прозрачным. Обе реакции могут происходить последовательно или одновременно.
|
| столбик желатина.
| Происходит разжижение (желатин разжижают Proteus vulgaris, Bacillus anthracis).
|
| Трипто-фаназа
| Мясо-пептонный бульон или среду с аминокислотой триптофаном, а также индикаторная бумажка, смоченная щавелевой кислотой и закреплена под пробкой над питательной средой.
| Образуется индол, который приводит к покраснению бумажки, смоченной щавелевой кислотой.
|
| Десуль-фурази (цыстиназы)
| Среды с цистеином, метионином и качественным реактивом на H2S - солями железа, свинца, висмута.
| Образуется H2S, который взаимодействует с Fe2 + (Pb2 +, Vi2 +) с образованием сульфида железа черного цвета, что вызывает почернение среды.
|
| ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ
|
| Липаза
| Желточный агар
| Липазы гидролизуют жиры на глицерин и свободные жирные кислоты. Вокруг колоний в свете на поверхности среды видны радужная пленка (похожа на бензиновую пленку на поверхности воды).
|
| Лецытиназа
| Желточный агар (до 300 мл стерильного МПА, расплавленного и охлажденного до 45-50 ° С, добавляют источник лецитина, желток куриного яйца).
| Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид, и вокруг колоний появляются опалесценцией????? зоны, или «венчики помутнения»; лецитиназы у Staphylococcus aureus, клостридий, фузобактерий.
|
| ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ
|
| Оксидаза
| Фильтровальная бумага, смоченная свежеприготовленным 1% раствором тетраметилпарафенилен-диамина (реактив на оксидазу).
| При нанесении бакпетлей 18-24 часовой культуры на поверхность фильтровальной бумаги в течение 1 мин появляется пурпурно-фиолетовая окраска; используют для дифференциации Pseudomonas spр. (оксидазоположительные) и энтеробактерий (оксидазонегативные).
|
| Каталаза
| 3% раствор Н2О2, присутствие каталазы определяют у микроорганизмов, выращенных на любой питательной среде, кроме кровяных сред.
| При нанесении на колонию перекиси водорода, или при внесении культуры в каплю перекиси на предметном стекле появляются пузырьки газа; используют для дифференциации Streptococcus spр. (каталазоположительные) и Staphylococcus spp. (каталазонегативные).
|
| ФЕМЕНТЫ-ТОКСИНЫ
|
| Гемолизины
| 5 - 10% кровяной агар.
| α-гемолизины приводят к неполному гемолизу с образованием вокруг колоний зоны неполного просветления среды, которая в течение 2-5 суток приобретает зеленовато-бурый оттенок.
b-гемолизины вызывают полный гемолиз с образованием прозрачной зоны вокруг колоний.
g-гемолизины не дают видимого глазом гемолиза.
|
| О-стрепто-лизин
| В пробирки с двукратными разведениями b-гемолитических стрептококков добавляют равный объем 5% эритроцитов кролика, инкубируют при 37 ° С 1 час; параллельно ставят контроль с суспензией эритроцитов в питательном бульоне.
| В положительных случаях происходит гемолиз (лаковая кровь), в негативных случаях образуется осадок из эритроцитов.
Определяют титр О-стрептолизина - наибольшее разведение микробной культуры при котором наблюдается гемолиз.
|
| Гиалуро-нидаза
| Пробирка с гиалуроновой кислотой и уксусной кислотой при добавлении к гиалуроновой кислоте уксусную кислоту образуется сгусток муцина.
| Если тест-культура образует гиалуронидазу, то после 15 мин инкубации культуры бактерий при 37 ° С в пробирку с гиалуроновой кислотой и добавить 2 - 3 капли уксусной кислоты образуется сгусток муцина.
|
| Фибри-
нолизин
| Сгустки фибрина.
| Растворение сгустков фибрина.
|
| | | | | |
Так, вместе с культуральными, морфологическими, тинкториальными свойствами необходимо изучать и биохимическую активность бактерий. При определении вида патогенных микроорганизмов наибольшее значение имеет определение сахаролитических и протеолитических ферментов у бактерий. Классический метод идентификации микроорганизмов по биохимическим признакам заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические среды. Исследование занимает не менее 1 сут. Примером является оценка способности ферментировать углеводы с помощью посева на среды Хисса - короткий и длинный "пестрый ряд".
При исследовании биохимических или ферментативных свойств бактерий чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают бактериальной петлей в среду "пестрого ряда". Посевы инкубируют при 37 º С в течение 18 - 24 часов. Бактерии ферментируют углеводы с образованием кислоты, наблюдается изменение цвета среды, и газа (появляются пузырьки газа в поплавке).Для выявления протеолитических ферментов посев можно выполнять на пептонной воде, желательно бульон Мартена.Конечными продуктами распада белков является сероводород, индол и др.. Выявление их осуществляется различными методами.
Обнаружение индола. К культуре микроорганизмов на пептонной воде добавляют несколько капель эфира, затем пробирку встряхивают и наслаивают реактив Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с соляной кислотой). При наличии индола наблюдается образование малинового кольца.
Обнаружение сероводорода. Бумажка, предварительно смоченная ацетатом свинца и размещена под пробкой, в пробирке с бульонной культурой при наличии сероводорода чернеет вследствии образования сернистого свинца.
