АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Одношарові культури клітин

Принцип методу одношарових культур клітин полягає у вирощуванні клітин, отриманих, як правило, шляхом ферментативної дезінтеграції на скляній поверхні у вигляді моношару, і базується на явищі адгезії – здатності клітин прикріплюватися до скляної поверхні. До одношарових культур відносять первинні, або первинно-трипсинізовані, диплоїдні, гетероплоїдні та постійні (перещеплювані) культури клітин (рис.2.19.).

Первинна культура клітин(первинно-трипсинізованан культура) – культура, яка походить від клітин та органів, взятих безпосередньо з організму. Для отримання первинних культур клітин використовують різноманітні тканини та органи людини та тварин. Після відповідної обробки їх подрібнюють на фрагменти 1-2 мм та оброблюють протеолітичними ферментами (трипсин, версен), які руйнують міжклтинні зв’язки, внаслідок чого отримують завись окремих клітин, які легко підрахувати.

Культури називають первинними до початку пасування чи субкультивування.

Як правило, культури, отримані з ембріональних тканин, характеризуються кращим виживанням та більш активним ростом у порівнянні з культурами з відповідних дорослих тканин. Це відображає більш низький рівень спеціалізації та наявність стовбурових клітин в ембріонах. Отримання первинних культур клітин дорослих тканин (в основному з нирок) та їх розмноження є більш складним завданням, і тривалість життя таких культур, як правило, не велика (максимум 20 генерацій при культивуванні in vitro у порівнянні з 50 генераціями первинних клітин, отриманих з ембріональних тканин). Первинні культури клітин мають різну чутливість до вірусів (табл. 2.10.). Така чутливість визначається типом тканини, з якої була отримана первинна культура, та тропізмом вірусу.

Рис.2.19. Схематичне зображення «розгалуження» клітин, що культивуються, від соматичної тканини

Приклади первинних культур клітин – нирка ембріону людини (рис.2.20), нирка макаки-резус, нирка африканської зеленої мавпи, нирка ембріону свині, фібробласти курячих ембріонів та ін.

З часу отримання субкультурипервинна культура отримує назву клітинна лінія. Клітинні лінії можуть мати обмежений час існування in vitro (наприклад, диплоїдні фібробласти людини та тварин), а можуть розмножуватися in vitro необмежено довго (постійні, безперервні або перещеплювані клітинні лінії).

Рис. 2.20. Первинна культура фібробластів людини

Штам клітин – це популяція однорідних клітин (за одним чи декількома маркерами), які зберігають специфічні властивості протягом обмеженого періоду культивування. Штам клітин може походити з первинної культури чи від лінії клітин шляхом селекції чи клонування клітин із специфічними властивостями.

Клоновими лініями, чи клонами, називають культури, вирощені з однієї ізольованої клітини.

Після висіву клітин на поживне середовище вони входять у фазу адаптації, або лаг-період, тривалістю 2-24 години, після якого починається період експоненційного росту (логарифмічна фаза) – кількість клітин збільшується у двічі через правильні проміжки часу (рис.2.21.). У кінці цього періоду клітини досягають правильного моношару і входять у період уповільненого росту чи спокою (стаціонарна фаза чи фаза плато). Якщо на даному етапі культивування не відбудеться перенесення клітин на свіже поживне середовище, то наступає фаза старіння та загибелі клітин. Розмножуючись, клітини розміщуються на поверхні скла і при повному його покритті в один шар контактують одна з одною і перестають ділитися (спостерігається явище контактного гальмування) (Рис 2.19). На склі формується шар товщиною в одну клітинну, тому такі культури клітин називають одношаровими чи моношаровими.

Рис. 2.21. Крива росту клітин у культурі:

1 – лаг - фаза;

2 – фаза експоненційного росту (логарифмічна фаза);

3 – стаціонарна фаза;

4 – фаза відмирання клітин.

Як правило, моношар формується через 3-5 діб. Швидкість його формування залежить від виду тканин, віку донора, якості поживного середовища, посівної концентрації клітин та інших факторів.

Поживне середовище замінюють по мірі його забруднення продуктами життєдіяльності клітин. Моношар зберігає свою життєздатність впродовж 7-21 діб (у залежності від виду клітин та поживного середовища).

Таблиця 2.10.

Чутливість первинних культур клітин до вірусів людини

Лінії диплоїдних клітин (напівперещеплювані лінії клітин) – це клітинні лінії, в яких, у крайньому випадку, 75% клітин мають каріотип нормальних клітин вихідного типу; такі культури клітин, трансплантовані хом'ячкам, не проявляють онкогенної активності. Диплоїдний набір хромосом не завжди еквівалентний диплоїдному каріотипу, оскільки існують умови, при яких клітина може втрачати один тип хромосом і набувати інший. Це значить, що каріотип клітини змінився, а диплоїдний набір хромосом зберігся. Такі клітини слід вважати “псевдодиплоїдними”. Диплоїдні культури можуть пасуватися багаторазово (диплоїдні штами), витримуючи до 80 популяційних поділів. Слід зазначити, що культури диплоїдних клітин дуже вибагливі до умов культивування, тому їх рідко використовують у вірусологічній практиці. Часто диплоїдні клітинні культури називають напівперещеплюваними культурами клітин.

Приклади диплоїдних культур клітин – WIТ-38 (фібробласти легень людини), MRC-5 (диплоїдні фібробласти людини), ТМ 4 (лінія клітин тестикулярного епітелію миші) та ін.

У випадку, коли клітинна лінія має менш ніж 75% клітин із диплоїдним набором хромосом, говорять про лінію гетеродиплоїдних клітин. Цей термін не означає, що клітини злоякісні чи здатні до необмеженого росту.

Постійна (безперервна, перещеплювана) клітинна лінія – складається із клітин одного типу, що здатні субкультивуватися поза організмом протягом необмеженого числа пасажів. Постійні клітинні лінії отримують із пухлинних або нормальних тканин людини або тварин, які мають змінений (трансформований) каріотип (табл. 2.11.). Використання постійних культур клітин у вірусологічній практиці має певні переваги в порівнянні з первинними та диплоїдними культурами клітин (табл. 2. 12.).

На рівні сучасних знань про поведінку клітин, що культивуються in vitro, неможливо визначити точку, коли культура стає стабільною, тобто набуває здатності рости необмежено довго. На основі досліду з фібробластоподібними клітинами людини встановлено, що культура повинна субкультивуватися не менш ніж 70 разів, з інтервалом у три доби, перш ніж її можна вважати безперервною лінією клітин.

У постійних культурах клітин клітини трансформовані. Під трансформацією клітин розуміють незворотні клітинні зміни, які характеризуються зміною ростових властивостей клітин, що культивуються. Трансформація робить клітини „безсмертними” і менш залежними від поживних та “геометричних” факторів росту. Зміни ростових властивостей пов’язані з порушенням транспорту через клітинну мембрану і є однією з адаптивних властивостей, які дозволяють клітинам розмножуватися в умовах, несприятливих для нетрансформованих батьківських клітин. При цьому клітинні мембрани втрачають поверхневий білок (250 кДа) і дещо змінюють антигенні властивості.

Спонтанна трансформація культур клітин нормальних тканин є відносно рідкісним явищем. Частоту таких трансформацій можна збільшити, оброблюючи клітини мутагенами чи деякими вірусами (наприклад, SV-40, вірус Епштейна –Барр та ін.).

Трансформовані клітини можуть утворювати пухлини у імунологічно толерантних тварин. За цією ознакою трансформація інколи неправомірно прирівнюється до злоякісних змін.

На ранніх стадіях культивування клітини залишаються еуплоїдними, тобто мають „правильний” диплоїдний набір хромосом, а пізніше вони стають анеуплоїдними. Іноді деякі з цих анеуплоїдних клітин виживають і продовжують розмножуватися, що призводить до встановлення клітинного штаму. Всі постійні клітинні лінії, на відміну від культур нормальних клітин з обмеженим терміном життя, є зміненими за рядом ознак, головною з яких є “безсмертя”. Здатність до необмежено тривалого розмноження в культурі, як правило, пов’язана з анеуплоїдним каріотипом. Для деяких клітинних ліній (наприклад, ВНК-21), які хоч і мають диплоїдний набір хромосом, каріотип змінений. Інші критерії трансформації (онкогенність, контактне гальмування, вимоги до середовища) проявляються у різних ліній неоднаково. Лінії клітин, які отримані з пухлинних тканин (тобто трансформовані в організмі), часто зберігають спеціалізовані функції (наприклад, здатність продукувати деякі ферменти) протягом більш тривалого часу, ніж клітини, трансформовані в культурі різними методами. Частота отримання постійних ліній у різних видів ссавців неоднакова. Так, наприклад, клітини мишей піддаються спонтанній мутації частіше, ніж клітини людини чи інших ссавців. Указана різниця, можливо, пов’язана з неоднаковою стабільністю каріотипу різних видів тварин.

При взаємодії вірусів з клітинами культури тканин спостерігаються різні зміни, обумовлені рядом факторів. Серед них велике значення має ступінь чутливості клітин культури до вірусу та умови середовища. Постіні культури відрізняються за ступенем своєї чутливості до вірусів. Як правило, для культивування певних вірусів підбирають такі культури, в яких зміни під впливом вірусної інфекції є найбільш виразними (табл.2.13).

Таблиця 2.11

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1983 | Нарушение авторских прав