АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Торможение метода.

К этому методу относятся конкурентные пробы, названные так по сути происходящего процесса. Торможение - это конечный эффект реакций.

В лунки микропланшета двух рядов вносят иммунный глобулин известной сыворотки для адсорбции на стенках лунок пластин (24 ч при комнатной температуре, рН 6,0). После экспозиции лунки трижды отмывают растворителем. Затем в лунки двух рядов вносят по 0,1 мл осветленного копроэкстракта, исследуемого пациента. Копроэкстракт был заранее приготовлен в пробирках в 5 последовательных разведениях (как описано выше). После экспозиции 30 мин при 37^о С, пластины трижды отмывают растворителем. В первый ряд с экстрактом вносят общим объемом 0,1 мл смесь сывороток: иммунную и эту же иммунную, но меченую каталазой. Во второй ряд - только иммунную сыворотку, меченую ферментом. После экспозиции 30 мин пластину трижды отмывают растворителем.

В оба ряда вносят перекись водорода, а через 15 мин и перманганат калия. Проводят учет реакции по изменению цвета лунок в сравнении с контрольным рядом (второй).

Если в исследуемом материале есть антиген, то в первом ряду произойдет конкуренция за детерминанты между мечеными и немечеными антителами. Результатом этого будет укорочение числа лунок с положительным результатом в первом ряду по сравнению со вторым, где конкуренции не было. Если антигена не было, то положительных лунок не будет ни в первом ряду, ни во втором, т.е. цвет лунок будет желтым.

ИФА считается одним из лучших методов, применяемых в практике, с высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяемые методы ИФА описаны в разделе для визуального учета, хотя существует автоматизация в прочтении результатов и постановке ИФА. При постановке на современной аппаратуре не виден механизм реакции, поэтому упор был сделан на постановку ИФА при визуальном прочтении результатов.

Следует учесть, что на сегодня разработаны новые методы, которые не относятся к иммунологическим, т.е. там нет взаимодействия антител с антигенами, например, зонды ДНК и др. или комбинированный молекулярно-генетический и электрофоретический метод - ПЦР.

ПЦР – полимеразная цепная реакция

Метод предложен американским исследователем Карри Мюллисом (1983), удостоенным в 1993 г Нобелевской премии. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Открытие термостабильной Tag-полимеразы (ДНК-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aguaticus, оптимум которой находится в области 70-72^о С, позволило делать процесс репликации ДНК циклическим. При этом происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК.

Комплементарное достраивание цепи начинается только в стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Присоединение таких блоков к специфическим участкам ДНК направляет процесс синтеза новой цепи только в этом участке ДНК.

Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК достаточно использовать две олигонуклеотидных затравки (20 нуклеотидных пар), называемых праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий, называемых амплификации, специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Tag-полимеразой.

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в разных температурных режимах.

1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95^о С в течение 30-40 сек.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значение которой располагается в интервале 50-65^о С. Время отжига 20-60 сек.

3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК идет от 5’ - конца к 3 ^’ -концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участка присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор gHTФ – дезоксирибонуклеотидтрифосфат. Процесс синтеза новой цепи катализируется ферментом - термостабильной Tag-полимеразой и проходит при температуре 70-72^о С. Время синтеза 20-40 сек. Образовавшиеся новые цепи служат матрицами для второго цикла амплификации, в которой происходит образование специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах ампликон служит матрицей для синтеза новых цепей. За 30-40 циклов рабочий раствор накапливает 10⁸ молекул ампликона.

. Исследуемым материалом служат соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка крови, плевральная жидкость и СПЖ, моча, мокрота, слизь и др.

Выделение ДНК из образца. Способ выделения ДНК зависит от вида возбудителя и от клинического образца. В некоторых случаях добавляют лизирующий агент, содержащий раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократное отмывание и ресорбция ДНК. В других случаях необходима депротеинизация фенолом или хлороформом с последующим осаждением ДНК этанолом или изопропанолом, обработка ведется в микроцентрифужных пробирках типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл. Время обработки 1,5-2 ч.

Проведение ПЦР. Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносят в специальную микроцентрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 0,5 мл. В эту же пробирку добавляют амплификационную смесь, состоящую из воды, ПЦР-буфера, раствора gHTФ, раствора праймеров и раствора Tag-полимеразы (добавляют в последнюю очередь). Объем реакционной смеси составляет 2,5 мкл. В пробирку добавляют одну каплю минерального масла для предотвращения испаренения жидкости. Пробирку переносят в программируемый термостат (амплификатор) и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду определенного возбудителя. Время проведения реакции в зависимости от программы составляет 2-3 ч.

Контроль реакции осуществляется одновременной постановкой ПЦР на клиническом материале: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала вносят контрольный препарат ДНК. Отрицательный контроль включает все компоненты реакции, а вместо клинического материала вносят соответствующее количество деионизированной воды.

Регистрация результатов. Амплифицированный специфический фрагмент ДНК можно выявить методом электрофореза в 1 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединенеи внедрения, проявляющееся в виде светящихся полосок при облучении геля УФ-лучами с длиной волны 290-330 нм. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия, охлаждают до 50^о С смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. После застывания геля в его карманы наносят амплификат, смешанный с буфером для нанесения образца, содержащего краситель. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером. Камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин. Гель просматривают в УФ-свете с помощью трансиллюминатора, желательно фотографируют. Результат оценивают по наличию в анализируемой пробе ДНК- фрагмента, пятно которого располагается на том же уровне, что и пятно контрольного ДНК- препарата. Такие фрагменты синтезируются при наличии в исследуемом материале клеток соответствующего возбудителя.

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 460 | Нарушение авторских прав