АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Феномен потребления комплемента

Прочитайте:
  1. IV. Захворювання, синдроми і феномени
  2. Kоагулопатия потребления не сопровождается потреблением
  3. ГЕМОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕНОМЕНЫ.
  4. Глава 4. Феномен и виды самоубийств
  5. Для конкретных видов потребления и марок
  6. Запомните определение темперамента и критерии, которым должны отвечать его черты. Разберитесь в значении феноменов кросс-ситуативности и онтогенетической стабильности.
  7. Запомните, какова частота встречаемости наркомании в популяции. Обратите внимание на феномен перекрестной предрасположенности к зависимостям от психоактивных веществ.
  8. Иммунитет. Неспецифические факторы защиты. Фагоцитоз. Опсонический индекс. Титрование комплемента, лизоцима.
  9. Иммунологические феномены
  10. Количественное определение комплемента в сыворотке крови.

Феномен составляют многочисленные реакции, объединенные одним принципом - лизис клеток с участием комплемента.

Прямой метод.

Реакции, основанные на лизисе клеток, достаточно многообразны и мы приводим одну.

РБЛ - реакция бактериального лизиса.

Метод не применяют.

Непрямой метод.

РНГем - реакция непрямого гемолиза.

Метод не применяют.

РСК - реакция связывания комплемента.

Для проведения реакции необходимо иметь:

1. Пробирки, штативы, пипетки, флаконы.

2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия.

3. Исследуемая сыворотка крови.

4. Комплемент.

5. Взвесь нативных эритроцитов барана.

6. Антиген известной специфичности.

Это сложная многокомпонентная, четырехэтапная, двухсистемная реакция. Клетками- мишенями являются нативные эритроциты индикаторной (гемолитической) системы.

1 этап. Определение рабочего разведения гемолитической сыворотки (таблица № 21).

В пробирках делают последовательные разведения гемолитической сыворотки в объеме 0,5 мл. В эти же пробирки вносят 3 % взвесь отмытых нативных эритроцитов барана в

Таблица № 21.

Схема определения рабочего разведения гемолитической сыворотки

  Номера пробирок и количество ингредиентов, в мл
Ингредиенты                
Гемсыворотка с 1:100 0,5 - - - - - -  
Растворитель 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Получаемые разведения 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800  
3 % взвесь эритроцитов 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Результаты РНГА ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + - -
Рабочее разведение гемсыворотки Титром гемсыворотки является 1:1600, значит рабочим разведением является (1:1600):3=1:533

 

объеме 0,5 мл. Через 60 мин экспозиции учитывают результат РНГА.

Рассчитывают рабочее разведение сыворотки – это разведение гемолитической сыворотки, сконцентрированное в 3 раза от титра РНГА.

2 этап. Титрование комплемента.

Готовят ряд пробирок: в первую из них вносят 0,05 мл комплемента в разведении 1:10, во вторую - 0,1 мл комплемента, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,2 мл, в пятую - 0,25 мл, в шестую - 0,3 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,4 мл, в девятую- 0,45 мл, в десятую - 0,5 мл. Одиннадцатая пробирка контрольная, которая содержит 0,5 мл растворителя.(таблица № 22).

Во все пробирки доливают растворитель до общего объема 0,5 мл, а затем вносят во все пробирки по 1 мл индикаторной системы и оставляют на 30 мин при 37 о С. После этого, все пробирки просматривают и выбирают наибольшее разведение комплемента, вызывающее гемолиз - это титр комплемента.

Таблица № 22.

Схема титрования комплемента (количество пробирок сокращено)

Ингредиенты Номера пробирок и количество ингредиентов, мл
               
Комплемент 1:10 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 0,14  
Растворитель 0,45 0,48 0,49 0,4 0,48 0,5 0,42 0,5
Разведения 1:100 1:90 1:80 1:70 1:60 1:50 1:40  
Гемсистема 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз осадок осадок осадок осадок
Рабочая доза комплемента Титр комплемента составляет 1:70, значит рабочая доза комплемента: (1:70х30):100= 1:21
                   

В реакцию берут разведение комплемента на 30 % выше, чем его титр, это рабочая доза комплемента.

3 этап. Приготовление индикаторной системы. К 3 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем разведении. Смесь выдерживают 30 мин при 37о С и осадок эритроцитов трижды отмывают растворителем при осаждении или центрифугировании при 500 об\мин в течение 10 мин. Осадок эритроцитов ресуспендируют до 3 % взвеси.

Постановка РСК. Титруют исследуемую сыворотку крови в пробирках от 1:50 до 1:12800 и делают контроли: на сыворотки (исследуемую, положительную и отрицательную), антиген, комплемент. Во все разведения сыворотки, кроме контроля сыворотки, вносят по 0,5 мл антигена. В контроль сыворотки, комплемента и антигена вносят по 0,5 мл растворителя. (таблица № 23).

Смесь встряхивают и во все пробирки добавляют по 0,05 мл комплемента в рабочей дозе. Смесь оставляют на 60 мин при 37о С

После экспозиции в каждую пробирку вносят по 1,0 мл индикаторной системы. Смесь встряхивают и выдерживают 60 мин при 37о С.

. При наличии в сыворотке гомологичных антител, комплемент расходуется на комплекс антиген-антитело первой системы. Это проявляется отсутствием лизиса индикаторных эритроцитов. При отсутствии антител в сыворотке комплемент не расходуется и тогда взаимодействует со второй системой (индикаторной). При этом эритроциты лизируются в первых пробирках.

Реакция связывания комплемента позволяет определять антитела, микробы, вирусы, растворимые антигены, однако он трудоемок и вытеснен при некоторых инфекциях другими методами.

 

Таблица № 23.

Схема постановки РСК

Дополнительные сведения Ингредиенты Номера пробирок и количество ингредиентов, в мл  
               
Разведения исследуемой сыворотки   Контроли  
сыворот- ка (+) сыворот- ка (_ ) компле- мент исслед. сывор. антиген  
Растворитель 0,5 0,5 0,5     0,5 0,5 0,5  
Исслед. сыворотка 1:50 0,5 - -       0,5    
Разведения 1:100 1:200 1:400       1:100    
Антиген 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5  
Комплемент 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5  
Заведомо отриц. сыв.         0,5        
Заведомо полож. сыв.       0,5          
Экспозиция 60 мин при 37о с  
Гемсистема 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0  
Экспозиция 60 мин при 37о С  
Результат РСК осадок осадок осадок осадок гемолиз гемолиз гемолиз гемолиз  
Результат анализа Исследуемая сыворотка содержит антитела, на что указывает осадок в первых пробирках с сывороткой и положительным контролем, при отрицательной реакции (гемолиз) в других контролях  
                               

 

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 491 | Нарушение авторских прав

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.004 сек.)