АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
ПОТЕНЦИАЛ ПОКОЯ
В течение длительного времени потенциал покоя измерялся как потенциал повреждения, т. е. регистрировалась разность потенциалов между участком нервной или мышечной ткани, где клеточная мембрана была разрушена, и участком интактной мембраны. По этим измерениям нельзя было судить об абсолютной величине потенциала покоя, поскольку невозможно избежать шунтирования регистрирующих электродов из-за того, что часть тока, величину которой трудно оценить, распространялась от поврежденного участка по тонкому слою жидкости к интактным областям ткани, минуя регистрирующие электроды. Кроме того, потенциал повреждения быстро уменьшался со временем.
Величину потенциала покоя стало возможным измерять с высокой точностью с введением в 50-е годы XX в. Грэхемом, Лингом и Джерардом в практику электрофизиологического эксперимента микроэлектродов — микросолевых мостиков. Микроэлектроды изготовляются из тонких стеклянных трубочек с оттянутым на одном конце кончиком, диаметр которого составляет доли микрона. Микроэлектрод заполняется концентрированным солевым раствором, например 3-молярным КС1. Со стороны широкого конца в трубочку вставляется металлическая проволока — платиновая или серебряная.
Для того чтобы избежать поляризации металла в солевом растворе, т. е. возникновения на регистрирующих электродах противоположно направленной измеряемому потенциалу электродвижущей силы, и тем самым исключить искажения в регистрации потенциала, на поверхность металла наносят тонкий слой его соли электролитическим методом. Например, в случае серебра — хлорид серебра. Такое покрытие создает значительный запас ионов Ag+ и С1~ на поверхности проволочки и служит промежуточным звеном между электронной проводимостью в металле (Ag+ + e~-»Ag) и ионным током, который обусловлен обменом ионами С1~ между слоем AgCl и раствором. Вследствие этого становится возможным двусторонний поток электрических зарядов от электронов в металле к ионам хлора в растворе и в обратном направлении без возникновения на электродах обратнонаправ-ленной электродвижущей силы. Такие электроды получили название неполяризующихся.
Для работы с микроэлектродами были разработаны электронные усилители постоянного тока, которые работают в электрометрическом режиме, т.е. имеют очень большое входное сопротивление и потребляют чрезвычайно малый ток от измеряемого источника ЭДС. Для измерения постоянных или медленно изменяющихся потенциалов к выходу усилителя можно подключить стрелочный индикатор, однако для регистрации быстрых изменений потенциала используют безынерционные электронные ос-
циллографы. С целью измерения потенциала покоя кончиком микроэлектрода прокалывают мембрану клетки, второй электрод (электрод сравнения) — также неполяризующийся электрод — помещают рядом с исследуемой клеткой. Его конструкция может быть самой различной: в простейшем случае это просто хлорированная проволочка. Нужно отметить, что прокалывание мембраны кончиком микроэлектрода клетки также, по сути, наносит клетке повреждение, но, как продемонстрировали многочисленные исследования, оно минимально. Подтверждением этого является тот факт, что регистрируемый потенциал может держаться на неизменном уровне в течение нескольких часов. Предполагается, что клеточная мембрана в месте входа микроэлектрода плотно обхватывает его стенки, предупреждая появление шунтирующего ионного тока вдоль наружной поверхности стеклянного кончика. Микроэлектродные измерения различных типов клеток животных показали, что потенциал покоя или, как лучше называть разность потенциалов на клеточной мембране — мембранный потенциал, имеет отрицательный знак внутри клетки (рис. 2А,А). Учитывая, что в наружной цепи источника ЭДС электрический ток течет от положительного полюса к отрицательному, ток через мембрану будет распространяться к электроду сравнения (внеклеточному), т. е. к наружной поверхности мембраны. В месте соединения солевой раствор/металл (AgCl/Ag) ионная проводимость переходит в электронную. Электронный ток на входном сопротивлении усилителя RBX создаст падение напряжения, очень близкое по величине к мембранному потенциалу клетки. Затем поток электронов в месте контакта Ag/AgCl, находящемся в стеклянной трубочке, переходит в поток ионов и через кончик микроэлектрода входит в клетку, замыкая цепь. Таким образом, измерения мембранного потенциала с помощью микроэлектродов подтвердило теорию Дюбуа-Реймона о том, что разность потенциалов через мембрану преформирована и не является результатом повреждения протоплазмы клетки. Преимущество микроэлектродного метода состоит в том, что можно исследовать мелкие клетки и проводить эксперименты на отдельных клетках, находящихся в организме без их изоляции.
Попытаемся теперь выяснить, каким образом устанавливается через мембрану, имеющую избирательную проницаемость к определенным ионам, разность потенциалов и как можно вычислить ее величину. Начнем с идеального случая. На рисунке 2.5 видно, что два раствора солей разделены мембраной. Раствор во внутреннем объеме (А) содержит 100 мМ КС1 и 10 мМ NaCl, снаружи (Б) — 100 мМ NaCl и 10 мМ КС1. Мембрана имеет каналы, диаметр которых позволяет проходить через них только гидратиро-ванным (т.е. окруженным оболочкой из молекул воды) ионам калия и молекулам воды. Гидратированные ионы натрия, превышающие в 1,5 раза диаметр гидратированных ионов калия, не прохо-
Рис. 2.5. Образование потенциала через идеальную мембрану:
| Л —внутренний объем, ограниченный мембраной; Б— внешний объем; Лвх — входное сопротивление регистрирующей системы; стрелками показано направление ионного тока, пунктирной линией — уровень раствора
| дят через данные каналы. Кроме того, на внутренних стенках этих каналов располагаются фиксированные отрицательные заряды, что препятствует прохождению через них отрицательно заряженных ионов хлора. При данных условиях из объема А в объем Б через каналы по своему концентрационному градиенту могут проходить только ионы калия. Но диффузии происходить не будет. Причина заключается в том, что ионы калия — положительно заряженные частицы. Движение только ионов калия в объем Б приведет к увеличению в нем положительно заряженных частиц, что сразу же проявится в возникновении задерживающей их положительной электростатической силы. Через мембрану возникнет разность потенциалов соответственно с положительным знаком снаружи и отрицательным внутри объема А, которую можно измерить с помощью описанной ранее регистрирующей системы. Добавление NaCl в растворы по обе стороны мембраны обеспечивает поддержание осмотического равновесия. При отсутствии NaCl возникло бы гидростатическое давление или же в случае податливости мембраны осмотический ток воды в объем А из объема Б. Таким образом, между объемом А и объемом Б, разделенными мембраной, установится электрохимическое равновесие, обусловленное равенством электрической работы, необходимой для перемещения небольшого количества заряженных частиц — ионов в одном направлении и осмотической работой, затраченной для перемещения того же количества ионов, в противоположном направлении. Известно, что электрическая работа Аэ, необходимая для переноса 1 моль ионов К+ против разности потенциалов Е, равна произведению заряда Q этого количества ионов на разность потенциалов:
A3=QE, (1)
но Q = nF, где п — валентность ионов (в данном случае она равна 1), a F— число Фарадея. Следовательно,
Аэ = EF. (2)
Осмотическую работу, необходимую для перемещения 1 моль ионов калия из области концентрации [К+]Б в область, где его концентрация [К+]А в 10 раз выше, легче всего оценить, проведя аналогию с работой по сжатию 1 г • экв идеального газа до 1/10 его первоначального объема. Идеальный газ состоит из частиц (молекул), не взаимодействующих друг с другом. Сжатие газа производится очень медленно, без изменения его температуры. Представим, что газ находится в цилиндре с подвижным поршнем. Механическая работа Ам равна произведению силы F на расстояние /: Ам — FI. В данном случае для очень малого перемещения А/ поршня действующая сила F равна произведению давления Р газа на площадь S поперечного сечения. Отсюда произведенная работа при малом перемещении поршня
ДА, = PSM. (3)
Учитывая, что произведение SA/— элементарный объем А К,
AAM=PAV. (4)
При медленном увеличении силы, действующей на поршень, произведенная работа по сжиманию идеального газа от объема V\ до объема V2, меньшего в 10 раз объема V\,
AM = \PdV. (5)
Согласно формуле Менделеева — Клайперона давление и объем газа связаны между собой обратно пропорциональной зависимостью:
PV = RT, (6)
Р = RT/V, (7)
где R — универсальная газовая постоянная; Т— температура.
Отсюда механическая работа
AM = \RT&VX/V. (8)
Вычисляя определенный интеграл, получим, что
А, = RT(\n V{ - In V2) = RT]n Vx/ V2. (9)
Отметим, что при сжатии газа с уменьшением его объема происходит увеличение концентрации его молекул. Поскольку между объемом и концентрацией существует обратно пропорциональная зависимость V— 1/[С], можно переписать формулу (9)
Ам= RTlniCh/iQi. (10)
Приведенные рассуждения применимы к вычислению осмотической работы, выполняемой при увеличении концентрации молекул растворенного вещества, т. е. при перемещении молекул в область их более высокой концентрации. Эту ситуацию легко смоделировать, представив, что в цилиндре находится не газ, а раствор с ионами и поршень сделан из полупроницаемой неподатливой (не изменяющей свои размеры) мембраны (см. рис. 2.5). Допустим, первоначально по обе стороны порш-нямембраны находится раствор, в котором концентрация КС1 составляет 10 мМ. Затем начнем медленно увеличивать давление таким образом, чтобы молекулы воды по каналам успевали выходить из объема А в объем Б без повышения температуры раствора. При достижении определенного давления на поршень-мембрану концентрация КС1 в объеме А увеличится в 10 раз. Осмотическая работа
Ло = ДЛп[С]Б/[С]А. (11)
Ионы К+ в соответствии с разностью их концентраций будут стремиться диффундировать через каналы поршня. Поскольку они являются заряженными частицами, увеличение количества положительно заряженных частиц, не скомпенсированное с отрицательно заряженными частицами, вызовет возникновение задерживающей их электростатической силы. Возникший потенциал компенсирует «диффузионное давление». В этом случае, как уже говорилось,
Аэ = Ао. (12)
Подставляя значения, получаем
EF = ДГ1п[С]Б/[С]А. (13)
Отсюда потенциал через мембрану
Е = (RT/F)\n([C}B/[C]A) или £аб = (RT/F)\n[K+]b/[K+]A. (14)
Это уравнение было выведено физикохимиком Нернстом и носит его имя. Следует отметить, что уравнение Нернста — самое известное и наиболее используемое. Приведен его первоначальный вывод, который базируется на простых термодинамических принципах, определяющих электрохимическое равновесие. Как следует из уравнения, потенциал через мембрану зависит от температуры и концентрации только ионов К+ по обе стороны мембраны. Этот потенциал получил еще и название равновесного потенциала, поскольку он уравновешивает разность концентраций ионов через мембрану.
Перейдя от натуральных логарифмов к десятичным и подставив значения универсальной газовой постоянной и числа Фарадея, можно вычислить величину потенциала при температуре 18 °С:
Е = 0,058 lg[ 10] /[100];
Е= 0,058 lg 0,1 = 0,058 (-1);
Е = -0,058 В = -58 мВ.
Таким образом, согласно расчету по уравнению потенциал имеет знак «минус».
От рассуждений о ситуации с идеальной мембраной перейдем теперь к примеру, более приближенному к реальным условиям: мембране между двумя объемами, пропускающей несколько ионов. На рисунке 2.6 изображены две ячейки, разделенные данным типом мембраны. Отметим также, что мембрана и стенки ячеек способны выдерживать большое гидростатическое давление. В исходном состоянии концентрации ионов К+ и С1~ в обеих ячейках одинаковы и находятся в равновесном состоянии. При добавлении в ячейку А калиевой соли, анион которой не способен проходить через каналы, в мембране происходит перераспределение ионов К+ и С1~. Ионы К+ будут выходить из ячейки А в ячейку Б. По аналогии с первым случаем (см. рис. 2.5) изменение концентрации заряженных частиц по обе стороны мембраны вызовет возникновение электростатической силы с отрицательным знаком со стороны ячейки А, которая заставит ионы С1~ перемещаться в ячейку Б, хотя движение С1~ будет происходить против образующегося и возрастающего концентрационного градиента. Этот процесс будет продолжаться до тех пор, пока разность концентраций,
|
| rJ
| }i
| Б
|
| А V»
|
| к+4
| fK+
|
| сг^
| &СГ
|
| Добавляем калиевую соль аниона (An), неспособную проходить че рез мембрану в ячейку А
| Рис. 2.6. Схема ионного равновесия Доннана:
Двх — входное сопротивление регистрирующей системы; стрелками показано направление ионного тока, пунктирной линией — уровень раствора
| РАВНОВЕСИЕ
заставляющих ионы К+ переходить из ячейки А в ячейку Б, не будет уравновешена противоположно направленной силой, заставляющей переходить ионы С1~ из ячейки Б в ячейку А. Две силы уравновесят друг друга тогда, когда отношение концентраций для К+ и С1~ по обе стороны мембраны будет удовлетворять равенству
[К+]А/[К+]Б = [С1-]Б/[С1-]А. (15)
Это явление названо равновесием Доннана, по имени Ф. Доннана, который в начале XX в. впервые исследовал распределение ионов в данной системе. Общая осмотическая концентрация в объеме А выше, чем в объеме Б, но стремление молекул воды переходить в объем А по своему концентрационному градиенту будет сбалансировано развившемся в объеме А гидростатическим давлением, равным разности осмотических давлений с двух сторон мембраны. Во время равновесного состояния стремление К+ переходить из ячейки А в ячейку Б будет равно стремлению С1~ переходить из ячейки Б в ячейку А. Однако ионы перемещаться не будут, поскольку этому препятствует образование разности потенциалов между двумя сторонами, которая уравновешивает концентрационные градиенты этих ионов. Величина этой разности потенциалов определяется по формуле Нернста
Е = RT/F[K+]S/[K+]A = RT/Fln [С1-]А/[С1-]Б. (16)
Исследования потенциала покоя у различных клеток (главным образом нервных и мышечных) с помощью микроэлектродов подтвердили справедливость основных положений мембранной теории. Так, экспериментально замеренные потенциалы покоя в ряде случаев были близки по значению с рассчитанным равновесным потенциалом для ионов калия. Вариации наружной концентрации ионов калия вызывали изменения в величине потенциала покоя, совпадавшие с вычисленными по уравнению Нернста, а изменения концентрации ионов натрия в окружающей клетку среде не нлияли на величину потенциала покоя. В то же время были получены данные, что мембраны, окружающие клетки, в отличие от идеальной мембраны пропускают в той или иной степени не один или два иона, а все неорганические ионы, находящиеся в окружающей клетку наружной среде, и поэтому представляют собой более сложные системы. Напомним, что электрохимический градиент того или иного иона не влияет на мембранный потенциал, если этот ион не способен проникать через мембрану, т.е. переносить заряды с одной стороны мембраны на другую. Кроме того, оказалось, что мембранный потенциал не будет зависеть от электрохимического градиента иона и в том случае, если его проницаемость через мембрану во много раз меньше легко диффундирую-
щего иона. Таким образом, относительная способность различных ионов к диффузии через мембрану определяет их вклад в потенциал, возникающий в результате диффузии. Приняв во внимание это положение, а также упрощенное допущение о том, что уменьшение потенциала при переходе от одной поверхности мембраны к другой происходит равномерно, Д. Голдман в начале 40-х годов XX в. на основании уравнения Нернста вывел новое уравнение, учитывающее относительную проницаемость мембраны для всех диффундирующих ионов:
Ем = RT/F\nPK[K+}0 + /WNa+]0+ Ра[СГ],/Рк[К+],+
+/WNa+], + Ра[СПо, (1?)
где Р — проницаемость для основных ионов, присутствующих во внутри- и внеклеточной среде; / — внутриклеточная концентрация ионов; 0 — экстраклеточная концентрация ионов. Поскольку валентность всех ионов равна 1, то п ■ F= 1 • F~ F.
Проницаемость определяется как отношение потока каких- либо частиц (нейтральных молекул, ионов) к их концентрации и характеризует скорость, с которой частицы проходят через мембрану в заданных условиях. Поток частиц можно представить как количество растворенных частиц (моль), которые пересекают единицу площади мембраны (см2) каждую секунду (моль/см2 • с). Концентрация вещества в каком-либо объеме будет измеряться как моль/см3. Поэтому размерность проницаемости будет выра жаться как моль/см2: с/моль/см3 =см/с, т. е. имеет размерность скорости. В соответствии с уравнением Голдмана вклад каждого иона в потенциал покоя или, как часто его называют, мембранный потенциал, будет тем меньше, чем меньше его проницаемость че рез мембрану. Кроме того, снижение концентрации иона также уменьшает его вклад в мембранный потенциал. Это хорошо иллю стрирует рисунок 2.7, на кото ром представлена зависимость мембранного потенциала мышеч ного волокна лягушки от вне клеточной концентрации ионов калия. При высоких значениях -40V- / концентраций ионов калия на-
-60
_во _ о/ Рис. 2.7. Зависимость потенциала покоя
мышечного волокна от концентрации ионов калия во внеклеточной среде:
1 — теоретическая зависимость, рассчитанная
по формуле Нернста; 2— кривая, построен-
0 020510255 10 20 50 100 ная по экспериментальным данным; по оси
' ' ' ' ги+1 м абсцисс — концентрация ионов калия; по оси
L l\ Jg, мм ординат — величина мембранного потенциала
клон кривой совпадает с теоретически рассчитанной и имеет, как и в случае с идеальной мембраной, наклон 58 мВ на десятикратное увеличение содержания ионов калия. При низких концентрациях кривые начинают расходиться из-за влияния ионов натрия, хотя проницаемость для этих ионов, определенная в опытах с радиоактивными изотопами, примерно в 100 раз меньше, чем ионов калия. Произведение i>Na[Na+]0 численно начинает приближаться к произведению Рц\ К+]0. Следует учитывать, что ионы хлора в мышечных волокнах лягушки распределяются пассивно в соответствии с величиной и знаком мембранного потенциала, т.е. отсюда следует, что не ионы хлора вносят вклад в мембранный потенциал, а мембранный потенциал определяет распределение ионов хлора. Поэтому при расчете мембранного потенциала в данном случае ионами хлора можно пренебречь. Вместе с тем исследования показали, что в других клетках ионы хлора не находятся в состоянии электрохимического равновесия по разные стороны мембраны и вносят соответствующий вклад в создание мембранного потенциала. Учитывая этот факт, уравнение Голдмана можно записать в упрощенном варианте:
Е* = RT/F 1пРк[К+]0 +^а^а+]0/Рк[К+], + PNa[Na+],- =
(18) = 0,0581gl[2,5] + 0,013[120]/1[140] + 0,013[10] = -89 мВ.
При физиологических значениях ионов калия в окружающей среде 2,5 мМ равновесный потенциал покоя по уравнению Нернста
EK=RT/F- In [K+]0/[K+] = 0,058 lg 2,5/140 = -102 мВ.
Значение Ем — —89 мВ заметно отличается от значения равновесного потенциала для ионов К+и согласуется со значением Ем = —90 мВ, полученным при микроэлектродных измерениях мембранного потенциала мышечной клетки.
Дата добавления: 2015-12-15 | Просмотры: 674 | Нарушение авторских прав
|