АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Специальные методы выделения и изучения вирусов.

Современная вирусология располагает широким набором методов идентификации вирусов, к которым относятся вирусоскопические и вирусологические методы, методы серодиагностики, иммунодиагностики и молекулярно-генегические методы исследования.

Целью вирусоскопического исследования является обнаружение крупных вирионов и внутриклеточных включений с помощью светового Вирионы могут быть выявлены также с помощью электронной микроскопии.

Цель вирусологического исследования - выделение вирусов и их идентификация до уровня вида. О наличии вируса в культуре клеток судят на основании следующих показателей:

• цитопатического действия, которое выражается в изменении морфологии клеток: уменьшении их размеров и формы, пикнозе ядер, образов гигантских многоядерных клеток (симпластое ной деструкции монослоя клеток, наличии внутриклеточных включений

• обнаружения специфических вирусных антигенов методом иммунофлуоресцеяции. Препараты из исследуемого материала обрабатывают специфической иммунной сывороткой, а затем флуоресцирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей изотиоцианат флуоресцеина (зеленое свечение) или сульфохлорид родамина, дающий красное свечение (непрямой метод), либо меченой специфической сывороткой (прямой метод). При люминесцентном микроскопировании препаратов при одних вирусных инфекциях специфический антиген выявляется в цитоплазме в виде ярко светящихся конгломератов различной величины и формы, при других инфекциях антиген обнаруживается в ядре. На поздней стадии инфекции клеток обнаруживается свечение всей массы цито­плазмы и ядра;

• метода цветной пробы, при котором клетки культуры ткани размножаются в среде с индикатором рН. В случае нормального развития клеток происходит закисление среды продуктами метаболизма и изменение ее цвета. Репродукция вируса в культивируемых клетках нарушает их нормальный метаболизм, и цвет среды не изменяется;

• феномена гемадсорбции и гемагглютинации. На поверхности клеток, зараженных вирусом, содержащим в составе суперкапсида гемагглютинии, экспрессируются значительные его количества, и клетки приобретают способность адсорбировать или агглютинировать добавленные к ним эритроциты. В первом случае реакция учитывается микро­скопически, во втором случае - визуально;

• образования бляшек под агаром. В монослое культивируемых клеток, покрытом тонким слоем агара с добавлением индикатора (например, нейтрального красного), в местах расположения погибших клеток формируются негативные или отличные по цвету колонии (бляшки);

• реакции интерференции, применяемой при отсутствии возможности использования перечисленных методов. Для этого культура клеток с исследуемым материалом дополнительно заражается лабораторным штаммом вируса, вызывающим цитопатическое действие. Считается, что морфологические изменения клеток наблюдаются только в случае отсутствия вирусов в исследуемом образце.

Идентификацию вирусов осуществляют методами серодиагностики, выявляя антитела и нарастание их титра в сыворотке крови с использованием различных иммунологических реакций, и методами иммунодиагностики, обнаруживая антигены с помощью диагностических про­тивовирусных сывороток. Идентификация вирусов с помощью серологических методов включает использование:

а) реакции торможения гемагглютинации (РТГА);

б) реакции задержки гемадсорбции и реакции нейтрализации (РН) с учетом результатов по гемадсорбции;

в) реакции связывания комплемента (РСК);

г) иммуноферментного анализа (ИФА);

д) реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА или РИГА).

РТГА используется для идентификации неизвестного вируса по известной специфической сыворотке или для определения специфических антител в сыворотках переболевших животных и человека по известным антигенам. Использование РСК позволяет обнаружить специфические компле-аощие антитела в исследуемых сыворотках и определить тип вируса.

Сущность метода ИФА состоит в том, что антитела диагностических сывороток метят ферментами (пероксидаза хрена, щелочная фосфатам и др.) и учет результатов реакции проводят под обычным световым микроскопом.

В РНГА один из компонентов (антиген или антитело) адсорбирован на эритроцитах, которые при образовании комплекса антиген - антитело склеиваются и выпадают в осадок. позволяет выявлять и идентифицировать неизвестный вирусный антиген, а также антитела и определять их титр в исследуемых сыворотках.

Молекулярно-генетические методы идентификации осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции, гибридизации с соответствующими ДНК- или РНК-зондами.

7. Генетика вирусов. Типы вирусных мутантов. ДИ -частицы.

Наряду с полными вирионами в процессе репродукции фор­мируются необычные по структуре и функции вирусные части­цы, которые можно объединить в три группы: псевдовирусы, вирусы-мутанты и вирусы-рекомбинанты. Псевдо- и мутантные вирионы возникают в чистых и смешанных культурах вирусов, а рекомбинантные - только в смешанных.

Вирусы-мутанты. В отличие от случайных, можно сказать кажущихся, вирионов в репродуктивных циклах вирусов зако­номерно появляются вирусные гибриды-мутанты (лат. mutatio -изменение), по структуре и фенотипу отличающиеся от роди­тельского (дикого) типа, но имеющие его генетическую основу, и немутационные гибриды. К появлению вирусов-мутантов при­водит спонтанный мутагенез, в основе которого лежит «оши­бочное» спаривание азотистых оснований. Ошибки происходят потому, что в природе существует две таутомерные (греч. tauto -те же самые, meros - часть) формы азотистых оснований. К тау-томеризму ведет постоянное перераспределение электронов и протонов в молекулах нуклеиновых кислот.

Различают 4 класса вирусов-мутантов: 1) вирусы с условно дефектными геномами; 2) ДИ-частицы, т. е. дефектные интерферирующие; 3) интеграционные вирусы с де­фектными геномами; 4) вирусы-сателлиты.

Условно-дефектные вирусы несут мутантные геномы, де­фектные в определенных условиях. Среди них чаще всего встре­чаются температурочувствительные ts- и холодочувствительные tc-мутанты, мутанты по спектру хозяев и мутанты по морфоло­гии бляшек.

Дефектные интерферирующие вирусы, или ДИ-частицы, представляют собой вирионы, у которых отсутствует некоторая часть геномной РНК или ДНК, но структурные белки остаются такими же, как у родительских вирусов. Как правило, длина нуклеокапсидов и размеры ДИ-частиц меньше родительских ди­ких вирусов. Репликация ДИ-частиц без родительских вирионов не происходит, но при совместном заражении клеток теми и другими она восстанавливается вследствие использования ген­ных продуктов дикого типа, которых они сами не вырабатыва­ют. Таким образом, для ДИ-частиц родительский вирус с полно­ценным геномом является вирусом-помощником (хелпером). Утилизируя для своей репликации продукты генов хелпера, ДИ-частицы вместе с тем угнетают репродукцию вируса-помощника, что в вирусологии называют интерференцией (лат. inter - взаимно, ferio - подавлять), отсюда и название - дефект-ные-интерферирующие.

Интеграционные вирусы с дефектным геномом - это мутан­ты-типы (или виды) ретровирусов подсемейства онкорнавиру-сов, содержащие one-гены (греч. oncoma - опухоль, англ. RNA -РНК), - прежде всего саркомные вирусы-гибриды, которые в процессе эволюции, как предполагают, приобрели клеточные опс-гены. Интегрируя с клеточным геномом, ДНК-транскрипты саркомных вирусов привносят в него опс-гены и, если они попа­дают под действие определенной регуляции клеток, после ко­роткого латентного периода вызывают злокачественное их пе­рерождение.

Особое место среди мутантов с дефектным геномом занима­ют вирусы-сателлиты, во многом сходные с ДИ-частицами. Так же, как ДИ-частицы, они паразитируют на генных продуктах ви­русов-помощников и часто интерферируют с ними, как, напри­мер, сателлит вируса некроза табака, полностью зависящий в своей репликации от одновременного заражения клеток табака его инфекционным вирусом-помощником, и вирусы-сателлиты, ассоциированные с родственными им вирусами растений, имеющими сегментированные геномы.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1081 | Нарушение авторских прав