АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Bystander-effect. Методы обнаружения. Биологическая роль.

До последнего времени считалось, что генетические последствия, вызванные воздействием облучения, связаны с эффектом прямого повреждения ДНК. Классическая догма радиобиологии, интерпретированная из теории мишени, постулирует, что генетические повреждения происходят только в процессе либо немедленно сразу после передачи энергии ионизирующих частиц ядерной ДНК (мишенные эффекты) и является следствием только прямого эффекта радиации либо воздействия короткоживущих радиационно-индуцированных радикалов кислорода; при этом биологические последствия наблюдаются в течение одного или двух клеточных поколений

Многочисленные данные, которые появились в последние годы, свидетельствуют о том, что ионизирующее излучение может вызывать биологические эффекты (включая повреждение ДНК), не пересекая ядро – то есть внемишенные эффекты. В ряде исследований было показано, что генетические изменения могут происходить в большем количестве клеток, чем ожидалось при облучении культуры клеток млекопитающих слабым потоком α-частиц, при котором только через очень малую часть клеток непосредственно проходили частицы. Эти и другие исследования (перенос облученной среды от клеток-доноров необлученным реципиентам, инкорпорирование радионуклидов и облучение с использованием пучка заряженных частиц показали, что облучение клеточного ядра не является необходимым условием для формирования генетических повреждений либо биологического ответа. Необлученные клетки, находящиеся в окружении облученных клеток либо реципиенты питательной среды от облученных клеток также могут отвечать на радиационное воздействие (рис.1).

Рисунок 1 Схема индукции байстзндер эффекта

Таким образом, основной чертой «внемишенных» эффектов радиации является то, что прямое облучение ядра (ДНК) не является необходимым для их проявления. Одним из таких внемишенных эффектов является «байстэндер эффект» (bystander effect) - это явление передачи информации, вызывающей клеточные повреждения, от клеток, пораженных каким-либо агентом, другим клеткам, на которые прямо этим агентом не воздействовали. Соответственно, радиоиндуцированный байстэндер эффект – это явление передачи информации, вызывающей клеточные повреждения, от облучённых клеток необлучённым.

К настоящему времени накоплено огромное количество экспериментальных данных, полученных на различных модельных системах, доказывающих наличие байстэндер эффекта.

1.2. Байстэндер эффект при облучении

В 1954 г. Парсонс показал, что у детей, которым облучали селезенку для лечения лейкемии, наблюдалось поражение костного мозга. Это является первым свидетельством того, что радиационное поражение не ограничивается облученными клетками.

В последние годы в лабораториях всех развитых стран продемонстрироно существование вызываемого облучением байстэндер эффекта, при котором повреждения возникают в необлученных клетках. В этих работах предполагается, что эффективное сечение мишеней потока радиоактивных частиц намного больше, чем размер ядра. В ранних работах Нагасава и Литтл по данной теме клетки культур Chinese hamster облучались альфа-частицами в дозах между 0.03 и 0.25 cGy, так, чтобы только около 1% клеток были подвержены прямому действию облучения. Однако хромосомные повреждения наблюдались более чем у 30% популяции. Таким образом, их данные показали, что повреждение ДНК может быть вызвано в большем количестве клеток, чем в том, которое подверглось облучению (рис.1).

Это было неожиданным и противоречило модели прямого повреждения. В данной статье изменялось представление об устоявшейся классической модели прямого поражения клеток. В течение последующих нескольких лет результаты, полученные в ряде лабораторий, подтвердили данный факт. Концепция байстэндер эффекта получила признание. Клеточные реакции, вызванные с помощью этого эффекта, включают в себя индукцию хромосомных аберраций, генные мутации, инактивацию и гибель клетки, апоптоз (или программируемую клеточную смерть), злокачественную трансформацию и генетическую нестабильность.

Было показано, что облучение 20-тью альфа-частицами приводит к увеличению частоты мутаций в 3 раза больше, чем ожидалось, полагая, что данный эффект не существует (рис 2).

Рисунок.2 Демонстрация байстэндер эффекта при воздействии радиации: одиночная альфа частица проходит через клетку A, передавая ей дозу радиации. Это в свою очередь приводит к повреждениям в клетках B, C, D, хотя доза прямого воздействия для данных клеток равнялось нулю.

Множество исследований байстэндер эффекта стали возможными благодаря использованию микролучей, позволяющих малому количеству заряда (легких ионов) попасть в единичное клеточное ядро (рис.2).

Последующие работы показали что,

(а) клетки, облученные прицельным микропучком альфа-частиц, могут индуцировать мутагенный ответ в близлежащих клетках, не подвергшихся прямому облучению,

(б) межклеточное взаимодействие играет основную роль в возникновении данного феномена.

1.3. Байстэндер эффект, вызванный различными видами излучения:

Байстэндер эффект в клетках, вызванный воздействием альфа-частиц:

Было признано, что альфа-частицы, пересекая ядро клетки и повреждая ДНК, вызывают генетические нарушения. Данные повреждения ДНК могут вызвать мутации или хромосомные аберрации в дочерних клетках. Эксперименты, проводимые Нагасавой (Nagasawa) и Литтлом (Little) в 1992 году, показали, что область генетических изменений, вызванных байстэндер эффектом, в 9-350 раз больше, чем область непосредственного поражения. Механизмы данного эффекта, вызванного воздействием облучения альфа-частицами, до сих пор остается неясным. Тем не менее, предполагают, что щелевидные соединения между клетками участвуют в его распространении после действия низких доз облучения альфа-частицами.

Байстэндер эффект, вызванный воздействием бета-частиц:

Байстэндер эффект, вызванный воздействием бета-частиц:

был продемонстрирован в многоклеточной модели с помощью группы клеток, помеченных тритиированным тимидином ([3H]dThd). Малая область распространения бета-частиц 3H вызывает лишь поражение меченых клеток, а немеченые клетки не повергаются воздействию излучения. Однако в результате, немеченые клетки также оказываются пораженными. Щелевидные соединения между клетками вовлекаются в байстэндер эффект, который имеет место до тех пор, пока линдан (γ-изомер гексахлороциклогексана), ингибитор межклеточных процессов, осуществляемых через щелевидные соединения, не проявит защитный эффект.

Байстэндер эффект, вызванный воздействием гамма-частиц:

Mothersill et Seimour разработали способ исследования байстэндер эффекта, индуцированного гамма-дучами.

Для этого использовали облучение клеточных культур эпителиальных клеток человека гамма-дучами. После облучения культуральную среду пропускали через специальные микропористые фильтры для удаления клеток. Отфильтрованную питательную среду переносили к интактным клеткам. Было показано, что культуральная среда от облученных гамма-лучами повреждает необлученные клетки – в клетках наблюдалось снижение жизнеспособности и колонеобразующей активности, а также возрастание частоты микроядер, что свидетельствовало о наличии байстэндер эффекта.

Различные способы исследования байстэндер эффекта изображены на рис 3

Рис.3. Методы изучения байстэндер эффекта

1.4. Как сравнить байстэндер эффект и эффект прямого повреждения?

Данные, полученные при изучении байстэндер эффекта, указывают на значительную разницу между байстэндер эффектом и эффектом прямого повреждения. Схематически на рис. 4 приведены для канцерогенных преобразований in vitro вклад эффекта прямого повреждения, байстэндер эффекта и их сумма.

При достаточно высоких дозах эффект прямого повреждения убивает все клетки в облученной популяции

Перевести на русский язык

Рис. 4 Схема удельных вкладов байстэндер эффекта и эффекта прямого повреждения в общее значение радиационного риска.

В этом случае вклад байстэндер эффекта незначителен и степень риска заболевания прямо пропорциональна плотности облучения. С другой стороны, байстэндер эффект наблюдается при облучении малой части клеток и повреждения обнаруживаются среди тех клеток, которые даже не подвергались воздействию. Обычно от 1 до 30 процентов необлученной фракции клеточной популяции могут обнаруживать повреждения вызванные байстэндер эффектом. В этом случае байстэндер эффект преобладает над эффектом прямого повреждения.

При прямом повреждении процент погибающих клеток прямо пропорционален дозе, а при байстэндер эффекте наблюдается низкий порог дозы, за которым клеточный ответ представляет плато – дальнейшее повышение дозы не вызывает увеличения количества поврежденных клеток.

Существуют две основные теории, объясняющие наличие плато. Одна из них - есть уже существующая доля клеток в популяции, которая чувствительна к сигналам об облучении соседних клеток. А вторая – то, что вся популяция клеток отвечает на сигналы, но также одновременно генерирует подавляющий сигнал, который ограничивает ответ определенной фракцией клеток.

Есть две основных области, где байстэндер эффект может играть важную роль. Первая связана с риском облучением низкими дозами естественного радиоактивного фона. Условная оценка облучения показывает, что естественный радиоактивный фон является причиной 3% всех случаев злокачественных опухолей, но является ли это преувеличением либо недооценкой – это частично зависит от предположений о биологическом действии на единичные клетки.

Байстэндер эффект также может иметь значение при некоторых видах лучевой терапии. Например, при лечении рака точечное воздействие радиации не всегда может достигнуть цели, и тогда необлученные клетки опухоли поражаются с помощью его механизмов.

1.5. Исследования байстэндер эффекта in vivo.

Радиационно-индуцированный «байстэндер» эффект не является исключительно явлением in vitro на клеточных культурах. Появляется все больше свидетельств того, что «байстэндер» эффект также может быть обнаружен in vivo.

Brooks и соавт. [1974] показали, что при накоплении α-источников в печени Китайского хомячка все клетки печени обладают одинаковым риском индукции хромосомных повреждений, даже если очень малая часть всей популяции подверглась облучению. В другом исследовании при трансплантации отличающихся цитогенетическими маркерами облученных и необлученных клеток костного мозга в последующих клонах гемопоэтических стволовых клеток наблюдалась хромосомная нестабильность [Watson и соавт., 2000].

В результате облучения нижней части легкого крыс наблюдалась повышенная частота микроядер в необлученной верхней части легких, которая снижалась при предварительном введении супероксид дисмутазы Схожий радиационно-индуцированный «байстэндер» эффект был описан у пациентов с хронической лейкемией и в костном мозге детей с хронической гранулоцитарной лейкемией в результате облучения селезенки

Особое значение «байстэндер» эффект имеет при фракционной терапии. Было показано, что культуральная среда от клеток, облученных несколькими фракциями, обладала более выраженным цитотоксическим эффектом при переносе клеткам-реципиентам по сравнению с средой от клеток, получивших одиночную равную дозу облучения. Этот эффект противоречит наблюдаемому восстановлению при прямом фракционном облучении культуры клеток – адаптивному ответу. Таким образом, образование «байстэндер» факторов in vivo может способствовать снижению «щадящего» эффекта, являющегося целью фракционной радиотерапии.

В настоящее время в некоторых клиниках врачи борются с солидными опухолями путем пространственной фракционной радиотерапии, опосредованной формированием «байстэндер» эффекта, что способствует регрессии опухолей и снижению дозы обучения пациентов Результаты этих и других исследований убедительно свидетельствуют, что «байстэндер» эффект существует не только исключительно в культурах, но и in vivo.

При остром облучении, выделение и эффект «байстэндер» факторов может быть больше и происходить в более короткие сроки. В то же время при хроническом низкодозовом облучении количество выделяемых в кровяное русло факторов может быть в очень малой концентрации, не способной вызвать клеточное повреждение вне зоны локализации источника. Таким образом, на основании этих исследований можно сделать вывод, что «байстэндер» эффект, индуцированный малыми дозами, не будет обладать каким-либо эффектом вне облученной ткани и, следовательно, не будет иметь большое значение in vivo.

Понимание эффектов радиации как скоординированного многоклеточного воздействия, поражающего не только облученные, но и необлученные клетки, позволяет определить вклад эффектов в необлученных клетках в оценку радиационных рисков. В результате при оценке радиационного риска во всех моделях канцерогенеза однозначно должны приниматься во внимание не только мишенные, но и немишенные аспекты радиационного воздействия.

Очевидно, что будущие терапевтические методы будут включать восстановление тканевой способности контролировать ответ на радиационное воздействие.

1.7. Механизмы

Повреждения в необлученных клетках могут быть объяснены возможностью взаимодействия клеток и передачей информации от одной клетки к другой. Механизмы, используемые клетками для обмена информацией о радиоактивном поражении, до сих пор не ясны.

Есть свидетельства существования как минимум двух независимых путей передачи повреждения от облученной клетки необлученным: через межклеточные взаимодействия и через клеточные факторы, секретируемые в культуральную среду.

В системах, где есть прямой контакт клеток, по-видимому, важную роль играют межклеточные коммуникации и сигнал передается через щелевидные соединения (узкие каналы, имеющие приблизительно 2 нм в диаметре, которые связывают цитоплазмы двух смежных клеток и способствует диффузии мелких молекул). (рис 3).

В системах, где нет прямого контакта, взаимодействие происходит косвенным путем, межклеточная передача информации может осуществляться (по крайней мере, в некоторых случаях) химически активными радикалами кислорода (ROS), вызванными действием ионизирующего излучения, или с помощью биологических Рисунок.3. Схема контактного механизма байстэндер эффекта

веществ. Было показано, что культуральная среда от α-облученных клеток способна индуцировать сестринские хроматидные обмены, увеличение генетических повреждений и снижение выживаемости клеток при её переносе необлученным клеткам.. Была выдвинута гипотеза, что облученные клетки выделяют цитотоксические факторы в культуральную среду, что способствует передаче сигнала необлученным клеткам.

Несмотря на то, что к настоящем моменту специфический фактор (сигнал) не был идентифицирован, возможный механизм может включать Ил-8, принимающий участие в α-индуцированном байстэндер эффекте.

Другим возможным медиатором байстэндер эффекта является апоптоз индуцирующий фактор (AIF), секретируемый митохондриями в ответ на окислительный стресс. Хотя AIF действует внутриклеточно, он может блокировать выделение экстраклеточных цитотоксических факторов в культуральную среду.

Имеются данные, что в процесс вовлекаются цитокины, которые выделяются клетками и играют специфическую роль в межклеточном взаимодействии.

Предполагается также, что повреждающий фактор обладает белковой природой, так как он термолабилен, не теряет эффекта при замораживании, а при воздействии ингибиторами белков не формируется.

Показано также, что происходит подавление таких генов как p53 и p21, вовлеченных в процессы контроля клеточного цикла и индукции апоптоза,

Неизвестно, формируется ли в результате воздействия различных типов ионизирующей радиации один и тот же фактор, или сигналы различаются по своей природе и эффекту.

Большинство информации было получено при исследованиях in vitro, однако имеются данные о существовании байстэндер эффекта in vivo.

1.6. Биологическая роль байстэндер эффекта

В настоящее время дискутируется вопрос о биологической роли байстэндер эффекта. Если данный эффект является повреждающим, увеличивающим число клеток, поврежденных одиночным радиационным треком, тогда не понятно, почему такой феномен сохранился в ходе эволюции? Зачем он нужен?

Предполагается, что главной функцией этого эффекта является уменьшение риска трансформации клеток в многоклеточном организме, подвергшемся облучению. Можно предположить, что защитные системы организма не всегда могут отреагировать на повреждения одиночных клеток внутри ткани, поэтому увеличение числа дефектных клеток необходимо для индукции и стимуляции систем, ответственных за уменьшение риска трансформации клеток в многоклеточном организме. При этом происходит репарация повреждений или апоптоз - удаление клеток, которые могли бы быть трансформированы, например, в раковые клетки.

Можно предположить также, что усиление повреждения («байстэндер эффект») при воздействии малых доз необходимо для индукции адаптивного ответа.

Если «байстэндер эффект» осуществляет в организме защитные функции, становится понятным, зачем эволюция его сохранила.

С другой стороны нельзя исключить и того, что «bystander effect» может усиливать эффект облучения, искажая зависимость «доза – эффект».

При расчете радиационных рисков используются модели, основанные на прямом действии облучения на ядерную ДНК. Однако, если «bystander effect» усиливает реакцию организма на воздействие ионизирующей радиации, то необходим перерасчет радиационных рисков, и в том числе риск канцерогенеза. При этом возможны различные формы нелинейности в зависимости «доза – эффект» в районе малых доз.

Знание этих закономерностей особенно важно для радиационной терапии рака, поскольку результат зависит от того, приводит ли «bystander effect» к увеличению числа трансформированных клеток или, наоборот, уменьшает их количество вследствие усиления летального эффекта.

Интерпретация байстэндер эффект может быть различной с точки зрения ожидаемого конечного результата. Если за параметр берется индукция трансформаций и/или мутаций, это может служить доказательством того, что опасность низких доз облучения выше, чем риск, вытекающий из зависимости «доза-эффект».

Как следствие, с одной стороны, большое внимание должно уделяться оптимизации процесса воздействия радиоактивного излучения в порядке предупреждения неоправданного облучения, которое может быть вреднее, чем предполагалось прежде.

С другой стороны, напротив, возрастающее количество апоптозов предполагает возможный защитный эффект, принимая во внимание, что потенциально пораженные клетки элиминируются из выжившей популяции

1.4. Модификация байстэндер эффекта

.

Модификация байстэндер эффекта (БЭ) химическими или физическими факторами (подавление или усиление эффекта) ещё больше усложняет зависимость биологических последствий облучения от поглощенной дозы.

В частности изучались эффекты некоторых радиопротекторных веществ, обладающих высокой антирадикальной активностью (меланина, мелатонина и альфа-токоферола) на степень проявления «байстэндер» эффекта в клетках-реципиентах.

Выбор протекторов был обусловлен следующими данными. Так, меланин способен перехватывать и превращать в тепло все виды физической энергии – магнитную, электрическую, радиационную, звуковую, тепловую и т.д.. Кроме того, меланин также является антиоксидантом, нейтрализует потенциально опасные свободные радикалы

Существуют доказательства радиопротекторного действия меланина. Этот пигмент повсеместно распространен в живом мире. Он проявляет свое радиопротекторное действие на начальных стадиях облучения, предотвращая повреждение ДНК и не влияя на репарационную систему.

Меланин очень эффективен при защите наследственных структур от мутагенного действия малых доз радиации, при этом чем ниже доза радиационного воздействия, тем выше протекторное действие меланина. Так, меланин способен полностью предотвращать эффекты малых доз радиации порядка 0,2 Гр. Всё это позволило предположить, что меланин может оказать воздействие на передачу сигналов от облучённых клеток к необлучённым.

Мелатонин – это нейрогормон шишковидной железы. Мелатонин секретируется в основном ночью, свет подавляет его секрецию. В организме мелатонин участвует в регуляции суточных и циркадных ритмов, регуляции температуры, снижает эффект "реактивной" болезни и обладает противоопухолевой активностью. Кроме того, мелатонин обладает антиоксидантными свойствами и способен нейтрализовывать многие из известных радикалов, а также усиливать секрецию некоторых противооксидантных ферментов.

Во многих исследованиях также было показано, что мелатонин обладает радиопротекторными свойствами.

Альфа-токоферол – витамин Е, известный своими радиозащитными свойствами и антирадикальной активностью.

В качестве тест-системы использовалась культура клеток кератиноцитов человека, иммортализованных вирусом папилломы человека. Клетки-доноры БЭ облучали в малых дозах ионизирующей γ-радиации. После выделения «байстэндер» фактора в культуральную среду, её фильтровали через 0,22 мкм фильтр и переносили необлученным клеткам-реципиентам, которые затем помещали в термостат и далее культивировали и обрабатывали в зависимости от используемого метода анализа (микроядерный или колониеобразующий тест).

Для того, чтобы вводимые в питательную следу протекторы не могли воздействовать непосредственно на сами донорские клетки при облучении, защищая их, что могло бы способствовать уменьшению образования повреждающих факторов, радиопротекторы вводили через 1 час после облучения, когда повреждающий фактор уже был сформирован, перед фильтрацией и переносом среды необлученным клеткам-реципиентам.

Кроме того, необходимо было убедиться, что протекторы не проходят через фильтр и не попадают к клеткам – реципиентам, осуществляя обычный радиозащитный эффект. Для этого с помощью спектрофотометра сравнили оптическую плотность культуральной среды, среды с добавлением протекторов и среды, отфильтрованной от облучённых клеток и протекторов. Интактная среда была идентична профильтрованной, что подтверждало отсутствие протекторов в переносимой клеткам – реципиентам среде.

Полученные данные показали, что перенос среды от облученных клеток необлученным способствует статистически значимому увеличению числа микроядер и снижению выживаемости клеток-реципиентов по сравнению с контролем, т.е. был выявлен БЭ. При введении радиопротекторов данный повреждающий эффект был достоверно ниже(рис.5,6).

Рис. 5. Влияние меланина на частоту клеток с микроядрами, индуцированными прямым облучением и переносом среды от облученных клеток

Что здесь – частота микроядер (см. по вертикали) или число клеток с микроядрами(заголовок?)

По результатам исследования, наибольшим защитным эффектом обладал мелатонин, наименьшим – альфа-токоферол. Таким образом, было показано, что радиопротекторы способны уменьшать повреждающий эффект «байстэндер» факторов.

Рис..6. Влияние мелатонина на частота клеток с микроядрами, индуцированными прямым облучением и переносом среды от облученных клеток

Что здесь – частота микроядер (см. по вертикали) или число клеток с микроядрами(заголовок?)

Таким образом показана возможность уменьшения байстэндер эффекта с помощью радиопротекторов меланина, способного абсорбировать все виды физической энергии и обладающего высокой антирадикальной активностью, и мелатонина, также обладающего высокой антирадикальной активностью. Учитывая, что все использованные защитные вещества обладают выраженными антирадикальными свойствами, можно предположить, что в механизме БЭ существенную роль играют факторы радикальной природы.

Поскольку предполагается, что главной функцией “bystander” эффекта является уменьшение риска канцерогенной трансформации клеток в организме, подвергшемся облучению, полученные данные по уменьшению байстэндер эффекта с помощью меланина и мелатонина имеют большое практическое значение для радиационной терапии рака.

При расчете радиационных рисков используются модели, основанные на прямом действии облучения на ядерную ДНК. Однако, если «bystander effect» усиливает реакцию организма на воздействие ионизирующей радиации, то необходим перерасчет радиационных рисков, и в том числе риск канцерогенеза. Использование радиопротекторов, способных подавлять межклеточную передачу радиационных сигналов, позволит управлять этим явлением как в целях радиационной терапии рака, так и для оценки радиационных рисков

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1968 | Нарушение авторских прав