АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Использование фагов в генетической инженерии в качестве векторов генетической информации.

Генная инженерия - это раздел молекулярной генетики, но, главное, - ветвь биотехнологии по созданию рекомбинативных ДНК (рекДНК) из различных видов организмов и вирусов, способных размножаться в реципиентной клетке или организме и детерминировать образование биологически активных веществ, обеспечивающих потребности народного хозяйства, биологии и медицины в частности. Генную инженерию иногда образно называют индустрией ДНК.

Конструирование генов

Конструирование комбинативных генетических структур, детерминирующих образование биологически активных веществ или других продуктов, основано на использовании двух методов - выделении (вырезании) генов и их синтезе – первый этап.

Передача и клонирование генов

На втором этапе генноинженерных работ выделенные и синтезированные гены с помощью рестриктаз вводят в кольцевые специализированные ДНК-векторы и сшивают их ДНК-лигазой в единую рекДНК, способную проникать в соответствующие клетки и благодаря наличию в векторах специфических ДНК-репликаторов, промоторов и терминаторов размножаться и избирательно накапливать генные продукты, что называют клонированием молекул ДНК.

В зависимости от того, в каких клетках реплицируются векторы, их делят на векторы прокариот, эукариот и челночные, содержащие репликаторы генетически неродственных организмов. В генной инженерии их получают от естественных репликонов: плазмид, бактериофагов, фаго-плазмид и вирусов.

Чаще всего из этих векторов используются плазмиды бактерий, особенно те, которые дают не 4-6 копий, как плазмида pSClOl кишечной палочки. В клетки животных гены вносят при помощи векторов, сконструированных на основе полиома-, папилома-, герпес-, адено-, ретровирусов и особенно ви­руса SV-40 и поксвируса осповакцины, в геном которого встраивают около 10% чужеродного генетического материала от его общей массы.

Для растительных клеток вектором могут служить плазмиды Ti Agrobacterium tumofaciens, вызывающие опухоли на корнях растений.

В тех случаях, когда подобрать вектор невозможно, прибе­гают к безвекторной передаче генов путем трансформации. Правда, передать гены таким образом удается только бактериям, включая их в питательную среду.

Частота трансформации бактерий прежде всего определяется степенью родства нуклеотидного состава ДНК донора и реципи­ента, на основе которого формируется трансформант, но зависит также от рН, ионного и белкового состава питательной среды, температуры культивирования и наличия особого фактора ком­петентности, имеющего структуру полипептида.

Компетентность бактерий, дрожжей, растительных клеток можно увеличить с помощью ферментов, разрушающих полисахаридный каркас оболочек и превращающих их в сферо- и про­топласты. Эффективность трансформации у бактерий возрастает при использовании хлорида кальция и теплового удара, а у эука­риот - полиэтиленгликоля, литиевых солей, высоковольтных импульсных электроразрядов, парагриппозного вируса Сендай, содержащего белок слияния.

И, наконец, некоторые возможности передачи генов откры­вает микрохирургия, позволяющая вводить чужеродную ДНК в ядра клеток.

В результате интенсивного развития генной инженерии всего лишь за последнюю четверть XX в. получены клоны многих ге­нов пептидных гормонов, инсулина, интерферона человека, овальбумина, коллагена, глобина, транспортных и рибосомальных РНК, гистонов и некоторых других. Особый интерес для биологии и профилактической медицины представляют вакцины будущего на основе безвредных рекомбинантных вирусов, в ге­номы которых введены гены широко распространенных инфек­ционных вирусов, кодирующих один или несколько специфиче­ских антигенов. Все это явилось предпосылкой для создания «банков генов» про- и эукариот на основе эталонных штаммов эшерихий и винных дрожжей.

25. Стадии репликации вирусов: адсорбция (рецепторы вирусов), проникновение, депротеинизация вирусной частицы, синтез предшественников вирусных нуклеиновых кислот и белков, сборка вирионов, выход вирусных частиц из клетки.

Репродукцией (лат. productio - производство) вирусов называют процесс размножения вирусных частиц в чувствительных к ним клетках.

В цикле репродукции тех и других вирусов различают четыре стадии: 1) подготовительную, или инициальную, включающую фазы адсорбции вируса на клетке, проникновения и раздевания в клетке; 2) собственно репродуктивную стадию образования структурных белков и вирионных нуклеиновых кислот; 3) сборку вирионов; 4) заключительную, сопровождающуюся выходом зрелых вирусных частиц из клетки.

Подготовительная стадия репродукции. Взаимодействие вирусов с клетками определяется наличием у них биологического сродства (тропизма), и прежде всего специфических рецепторов. С них и начинается «узнавание» вирусом чувствительных клеток. Находятся они на поверхности наружной мембраны клеток в большом количестве, не менее 104 - 105. По химической структуре рецепторы разнородны - молекулы-белки, углеводные или липидные компоненты протеидов. Адсорбция этих и других вирусов на соответствующих рецепторах осуществляется с помощью имеющихся у них прикрепительных белков. У простых вирусов прикрепительные белки содержатся в капсидах, у сложных - в суперкапсидах, например в шипах или булавовидных утолщениях у коронавирусов.

Следующая за адсорбцией фаза проникновения вируса в цитоплазму клетки реализуется двумя способами - пассивным путем виропексиса или активным путем слияния (интеграции) вирусной оболочки с клеточной мембраной.

Виропексис представляет собой своеобразную форму эндоцитоза, при котором вирус проникает в клетку путем впячивания мембраны с образованием вокруг него вакуоли и поэтапным ее слиянием вначале с более крупной цитоплазматической вакуолью, а далее - с лизосомой или же с внутриклеточными мембранами, включая ядерную.

Второй, более редкий путь проникновения вирусов в клетку происходит посредством интеграции вирусных оболочек с наружной мембраной. Отмечается он лишь у тех видов вирусов, которые наделены белками слияния. Как и прикрепительные, белки слияния содержатся в капсидах простых и суперкапсидах сложных вирусов.

Способность к репродукции вирусы приобретают только после освобождения их нуклеиновых кислот от оболочек, что принято называть фазой раздевания (депротеинизации). Осуществляется раздевание вирусов ферментами поверхностных плазматических мембран клеток-хозяев при слиянии с ними вирусных оболочек, а при виропексисе - ферментами лизосом и внутриклеточных цитоплазматическйх и ядерных мембран.

Конечными продуктами раздевания у ряда вирусов являются, правда, не голые нуклеиновые кислоты, а НК, связанные с внутренним вирусным белком (пикорна-, аденовирусы), нуклеокапсидом (вирус гриппа) или сердцевиной (аденовирусы).

Собственно репродуктивная стадия. Истинно репродуктивная стадия, включающая фазы транскрипции, трансляции и репликации, у разных групп вирусов и семейств неодинакова.

Так, транскрипция, или переписывание нуклеиновых кислот вирусов на иРНК, как первый ее этап, у ДНК-содержащих семейств папова-, адено- и герпесвирусов, репродукция которых происходит в ядре, осуществляется клеточной РНК-полимеразой, а у репродуцирующихся в цитоплазме иридо- и поксвирусов — вирусоспецифической, попадающей в клетку вместе с их геномом.

Второй этап реализации генетической информации вирусов - трансляция, в процессе которой синтезируется их белок, начинается с узнавания клеточными рибосомами вирусных иРНК, чему способствуют особые вирусоспецифические инициаторные факторы.

В процессе трансляции у вирусов, кодирующих синтез одной длинной иРНК, синтезируется гигантский полипептид-предшественник, впоследствии нарезающийся на несколько различных белков, а у вирусов, кодирующих короткие иРНК, - соответствующее им число полностью созревших белков.

Репликация ДНК-содержащих вирусов, или копирование их генома, представленного линейной двухцепочечной структурой, сходна с репликацией ДНК клеток и осуществляется их ДНК-полимеразами. Другими словами, синтез гомологичных нуклеиновых кислот происходит на обеих расплетенных цепях, в результате чего каждый вновь образующийся вирион получает ДНК, состоящую из старой цепи и ее новой копии. Следует, правда, подчеркнуть, что раскручиванию кольцевых двухцепочечных ДНК предшествует разрезание одной из ее нитей, а репликация однонитчатых ДНК-содержащих парвовирусов происходит после синтеза второй цепи ДНК и образования промежуточных двухцепочечных его форм.

Репликация вирусных РНК тоже происходит не на родительских, а на промежуточных комплементарных нитях. При этом синтез тех и других нитей РНК, так же как иРНК, осуществляют не клеточные, а вирусоспецифические РНК-полимеразы. Процесс репликации комплементарных нитей РНК у минус-нитевых вирусов хотя и очень схож с процессом синтеза иРНК при транскрипции, но они не аналогичны друг другу. В отличие от относительно коротких иРНК, комплементарных отдельным участкам генома, комплементарно-репликативные РНК считываются с полного генома и по существу представляют собой антигеном. Следовательно, в инфицированных вирусами клетках существует механизм переключения частичного считывания генома (транскрип­ции) на сквозное (репликацию).

Вновь синтезированная при сквозном считывания антигенома геномная РНК может служить матрицей для синтеза новых ее копий или иРНК, т. е. войти в состав вириона или функционировать как иРНК.

Сборка вирионов. Сборка вирусных компонентов в корпускулярную частицу - сложный и до конца не выясненный процесс. Хорошо известно лишь то, что при формировании простых вирусов в ее основе лежит самопроизвольный механизм белок-нуклеиновой сборки.

У сложно устроенных вирусов сборка происходит поэтапно и во многом зависит от того, где происходит их репликация - в цитоплазме или ядре.

Начинается она всегда с формирования нуклеокапсидов (сердцевин) и синтеза суперкапсидных белков. При этом образование первых происходит в специальных структурах клеток, или «фабриках», индуцированных вирусами, а вторых — в полирибосомах, связанных с внутриклеточными мембранами. Затем нуклеокапсиды, глико- и липопротеиды суперкапсидов РНК-вирусов мигрируют в места их сборки, которыми обычно являются мембраны эндоплазматических сетей, а чаще - поверхно­стные мембраны клеток. Связывание нуклеокапсидов с суперкапсидными субъединицами может происходить без или с участием матриксных мембранных М-белков вирионов, способных к белок-белковым и белоклипидным взаимодействиям.

Процесс сборки ДНК-содержащих вирусов еще сложнее. Начинаясь с формирования сердцевин или нуклеокапсидов, протекает через образование неполных форм вирионов с разным содержанием ДНК в капсидах и незрелых вирионов с полностью ненарезанными в них предшественниками полипептидов, свойственных зрелым формам вирионов.

При окончательном формировании зрелых вирионов в их внешние оболочки часто включаются липиды, углеводы, белки и даже ферментные системы клеток-хозяев.

Заключительная стадия репродукции. Конечным этапом репродукции вирусов является выход сформированных вирионов из инфицированных клеток. При этом возможны два пути их освобождения: 1) отпочковывание от клеток, присущее сложным вирусам, имеющим липопротеидную оболочку; 2) разрушение клеток, которое в основном вызывают безоболочечные простые пикорна-, рео-, парво-, папова- и аденовирусы.

26. Основные типы репликации вирусных геномов: (+)-РНК -геномы, двухцепочечные РНК-геномы,

Пикорновирусы (эти вирусы вызывают некоторые заболевания: полиомиелит человека, ящур крупного рогатого скота и др.) Помимо этих вирусов к пикарновирусам относятся и другие вирусы.

Тогавирусы (вызывают энцефалиты, желтую лихорадку).

Геномные РНК этих вирусов выполняют две функции. Во-первых, они выступают в качестве иРНК, т.к. последовательность нуклеотидов в геномной РНК данных вирусов идентична последовательности нуклеотидов в иРНК, т.е. их геном представлен «+»РНК или, как часто описывают эти вирусы, - вирусы с позитивным РНК геномом. После проникновения внутрь клетки данная РНК после депротеинизации может служить сразу иРНК, т.к. она имеет стартовые кодоны, участок для взаимодействия с рибосомой, аденилирована, имеет «шапочку» на 5^'- конце. Поэтому такая геномная РНК может сразу подвергаться трансляции с образованием соответствующих продуктов в числе которых будут продукты необходимые для последующих стадий репродукции вируса.

Геномная РНК пикорна- и тогавирусов является инфекционной и в «голом» виде может, при введении в клетку, вызывать ее заражение и обеспечивать репродукцию вирусного потомства, т.к. она сразу транслируется клеточными рибосомами. При трансляции таких геномных РНК, формируется крупный белок (полипептид), который в результате последующего процессинга формирует белки меньших размеров, которые выполняют соответствующие функции. Различают два этапа процессинга, в результате которых формируются три типа белков. (Рис.5.2, л.5)

Пикорнавирусы названы так, исходя из их малых размеров. Родительская геномная РНК способна транслироваться рибосомами клетки без всяких дополнительных факторов. После трансляции формируется крупный белок, который процессируется с образованием белков разных функциональных характеристик. Среди этих белков при первом процессинге имеются белки, которые обеспечивают синтез РНК-молекулы, комплементарной геномной молекуле РНК, в последующем выступающей в качестве матрицы для синтеза уже геномной «+»РНК. Среди этих белков появляется РНК-полимераза, работающая на РНК-матрице (таких полимераз в клетках не существует). Это специфический фермент для синтеза вирусных РНК. РНК-полимеразы вируса, который обеспечивает синтез «-»нити, участвующей в репликации геномной РНК. Таким образом, первая функция геномной РНК РНК-содержащих вирусов с позитивными геномами является обеспечение трансляции вирусных белков. А вторая – это функционирование в качестве матрицы для синтеза «-»нити РНК, т.е. геномная РНК, служит для трансляции и для синтеза «-»нити (она нужна для последовательных синтезов «+»нитей для трансляции и для геномов).

Геномы тогавирусов также инфекциозны. Они тоже могут быть транслированы, они также аденилированы, имеют сайты для взаимодействия с рибосомами и сайты инициации трансляции, но отличаются от пикорнавирусов тем, что в них различают две стадии или два цикла трансляции белков. В первом цикле трансляции транслируется только часть геномной РНК, и синтезируются белки необходимые для транскрипции геномной РНК и его остающейся части. Образующаяся в процессе транскрипции «-»нить РНК, является, опять же, матрицей для синтеза комплементарных РНК, но двух типов. Молекулы первого типа представляют собой иРНК и дополняют иРНК, которая транслировалась на первом этапе. Второй тип будет являться геномной РНК. Он будет соответствовать по размеру геному (рис.5.3, л.5).

Первый цикл трансляции: транслируется часть генома и трансляция этой части генома обеспечивает синтез белков (неструктурных белков), кодируемых от 5'-конца. Среди этих белков главным образом белки обеспечивающие транскрипцию этой матрицы. Возникает комплементарная «-» РНК, которая не входит в состав вирусной частицы, ибо геном «+»РНК. Эта матрица ферментами транскрибируется с одной стороны геномной РНК, а с другой стороны иРНК, которая содержит информацию недотранслированную на первом цикле трансляции информацию. С этой иРНК на 2-ом цикле трансляции синтезируются белки с 3’-конца, являющиеся структурными белками, которые после определенного протеолитического процессинга участвуют в формировании зрелых вирионов. Т.е. тогавирусы отличаются от пикорнавирусов тем, что у них два цикла трансляции.

Следует иметь в виду, что геномная РНК этих вирусов является инфекциозной, т.к. она транслируется и в изолированном виде, может инициировать процесс репродукции вируса, т.к. при ее трансляции появляются все необходимые для этого белки, которые будут реплицировать геном, обеспечивать транскрипцию и т.д.

27. Основные типы репликации вирусных геномов (-)-РНК-геномы, (+)-РНК-диплоидные геномы.

Ко второй группе вирусов, содержащих однонитевую РНК, относятся орто- и парамиксовирусы (возбудитель кори, свинки), рабдовирусы (возбудитель бешенства). Эти вирусы относятся к вирусам с негативным РНК-геномом. Характерно, что их геномная РНК должна выполнять функцию матрицы, чтобы формировалась геномная РНК потомства. Вирусы эти для обеспечения своей репродукции должны иметь в составе генома полимеразу, которая обеспечит репликацию.

Образующаяся «+» -нить служит на определенном этапе матрице й для синтеза геномной «-»-нити РНК. Изолированная РНК данных вирусов не является инфекционной. Возникающа я иРНК этих вирусов при репликации аденилируется и потом легко взаимодействует с рибосомой.

Репродукционный цикл вирусов с негативным РНК-геномом не нуждается в репликативных ферментах клетки хозяина. Они не проникают в ядро, репродукционный цикл идет в цитоплазме.

Процесс сплайсинга обуславливает появление различных иРНК, обеспечивающих синтез соответствующих белков.

К этой группе относятся вирусы, которые репродуцируются несколько отличным способом. Некоторые из них проникают в ядро, где идет синтез нуклеокапсида, а сборка завершается в цитоплазме. Пример: вирус гриппа.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1642 | Нарушение авторских прав