 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Ингредиенты ПЦР
Полимеразная цепная реакция происходит в несколько этапов: 1) денатурация - образование из двуцепочечной ДНК одноцепочечной молекулы; 2) отжиг - ограничение амплифицируемого фрагмента путем присоединения прямого и обратного праймеров; 3) элонгация - полимерезации дочерних цепочек на ДНК-матрице. Каждая из этих стадий протекает при определенной температуре. Реакцию амплификации повторяют 20-45 раз, предваряя ее дополнительной денатурацией и заканчивая дополнительной элонгацией. Температурно-временные режимы ПЦР: 1. Первоначальная денатурация. Выполняется 1-3 минуты при 95°C. На этой стадии из дуплексов исходной геномной ДНК образуются одноцепочечные молекулы ДНК. 2. ПЦР-цикл. Количество циклов зависит от количества исходного материала ДНК. Если количество исходных ДНК-копий менее 10, необходимо проводить 40 – 45 циклов, если более – 25 - 35 циклов. а) стадия денатурации. Осуществляется при 94 - 95°C в течение 0,5-2 минут. На этой стадии из дуплексов амплифицированной ДНК образуются одноцепочечные молекулы. Уменьшение времени реакции по сравнению со стадией первоначальной денатурации обусловлено тем, что синтезируемые в процессе ПЦР продукты короче, чем исходная цельная ДНК. б) отжиг праймеров. На этой стадии праймеры присоединяются к комплементарным участкам ДНК и ограничивают фрагмент для амплификации. Для отжига достаточно 0,5-2 минут. Температура для этой стадии рассчитывается по формуле: Tm=4(Г+Ц)+2(A+T) - 5, где в) стадия элонгации. На этой стадии Taq-полимераза присоединяется к 3¢ концу праймера и синтезирует на ДНК-матрице копию, после чего из одноцепочечных фрагментов ДНК образуются дуплексы. Осуществляется при 70-75°C в течение 1 минуты. 3. Финальная стадия элонгации. После последнего проведенного цикла образцы инкубируются при 72°C в течение 5-15 минут для образования дуплексов. В результате ПЦР происходит экспоненциальное увеличение копий ДНК (ампликонов), описываемое формулой 2n, где n - число циклов амплификации. Образование огромного количества копий (108) позволяет выявлять их путем электрофореза в агарозном или акриламидном геле с последующей окраской ДНК-красителем - этидием-бромидом, флюоресцирующим в УФ-свете (290 нм) трансиллюминатора. В процесс электрофореза фрагменты ДНК передвигаются в зависимости от молекулярной массы и полярности и образует видимую в УФ-свете полосу. Достоинства метода: 1) высоко чувствителен (позволяет обнаружить микроорганизмы в материале в концентрации 1 – 10 клеток); 2) высоко специфичен (позволяет идентифицировать большинство существующих микроорганизмов). Недостатки: требует дорогостоящего оборудования. Биочипы Метод биочипов, или микроэррэй, – метод, основанный на одновременном проведении большого количества (25 000 – 50 000) молекулярно-биологических реакций на микроносителях (чипах). Биочип – это миниатюризированные подложки из стекла, нейлоновых и других материалов, на которых иммобилизованы десятки тысяч проб (ДНК, олигонукдеотидов, пептидов, клеток), при этом размер одной нанесенной пробы не превышает 200 – 300 микрон. Метод используют в диагностике заболеваний, идентификации генов и изучении их экспрессии, сравнительном анализе геномов и протеомов. Метод позволяет идентифицировать: 1) нуклеиновые кислоты (эукариотическую и прокариотическую ДНК, продукты полимеразной цепной реакции, РНК, мРНК); 2) белки (антитела/антигены, цитокины, ферменты, внутриклеточные белковые молекулы); 3) целые клетки (опухолевые). Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 592 | Нарушение авторских прав |