АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Метод ферментативного секвенирования (метод Сэнджера)

Прочитайте:
  1. A. Предмет и методы отрасли
  2. Bystander-effect. Методы обнаружения. Биологическая роль.
  3. c) комбинированный метод
  4. C. Немедикаментозні методи
  5. Dot–ИФА. Метод точечного иммуноферментного анализа
  6. I. Методы симптоматической психотерапии
  7. II МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  8. II. МЕТОДЫ ОПЕРАЦИЙ И МЕТОДИКА ОБСЛЕДОВАНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ В ХИРУРГИИ КИСТИ
  9. III. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
  10. IV. Методические указания студентам по подготовке к занятию

Принцип метода. В основу ферментативного секвенирования положена ПЦР, отличающаяся от обычной дополнительным присутствием веществ, обрывающих удлинение цепи ДНК – терминаторов, или дидезоксинуклеотидтрифосфатов (ддГТФ, ддАТФ, ддЦТФ, ддТТФ), меченых флюорофором. На изучаемой ДНК, выступающей в качестве матрицы, при помощи секвеназы (разновидность ДНК-полимеразы) синтезируется комплементарная цепочка, в которую в любой момент с начала синтеза может быть встроен, вместо обычного Г, А, Ц, Т, соответствующий терминатор - дидезоксинуклеотидтрифосфат (ддГТФ, ддАТФ, ддЦТФ, ддТТФ). После этого ДНК-полимераза неспособна присоединять следующий нуклеотид и цепь обрывается. В реакции секвенирования концентрации терминаторов (ддГТФ, ддАТФ, ддЦТФ, ддТТФ) и обычного строительного материала ДНК (дГТФ, дАТФ, дЦТФ, дТТФ) подобраны таким образом, чтобы в процессе проведения 25 – 30 циклов сиквенс-ПЦР образовывалось огромное количество фрагментов, терминированных по всем присутствующим в ДНК нуклеотидам. При проведении электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле, позволяющем разделять фрагменты различающиеся в один нуклеотид, каждый фрагмент занимает определенное место, соответствующее его размеру. Так как терминаторы мечены флюорофором, то фрагменты флюоресцируют, что регистрируется прибором - автосеквенатором, который выдает результаты (последовательность нуклеотидов в цепи) в графическом и текстовом формате. Могут быть использованы два подхода, чтобы определить, каким нуклеотидом терминирован фрагмент:

1) Если четыре терминатора (ддГТФ, ддАТФ, ддЦТФ, ддТТФ) мечены одним флюорофором, то ставят реакции в четырех разных пробирках по отдельности с каждым из терминаторов. Электрофорез осуществляют также отдельно для каждой из четырех проб. Автоматический анализатор сопоставляет положение фрагментов для каждого из терминаторов и суммирует результат (рис. 15).

 
 

2. Если четыре терминатора (ддГТФ, ддАТФ, ддЦТФ, ддТТФ) мечены разными флюорофорами, то проводят ПЦР-реакцию одной пробы, автосеквенатор регистрирует различный вид флюоресценции от каждого из терминаторов.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 541 | Нарушение авторских прав

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.003 сек.)