АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Метод секвенирования путем химической деградации (по Максаму- Гилберту)

Прочитайте:
  1. A. Предмет и методы отрасли
  2. Bystander-effect. Методы обнаружения. Биологическая роль.
  3. c) комбинированный метод
  4. C. Немедикаментозні методи
  5. Dot–ИФА. Метод точечного иммуноферментного анализа
  6. I. Методы симптоматической психотерапии
  7. II МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  8. II. МЕТОДЫ ОПЕРАЦИЙ И МЕТОДИКА ОБСЛЕДОВАНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ В ХИРУРГИИ КИСТИ
  9. III. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
  10. IV. Методические указания студентам по подготовке к занятию

В ферментативном секвенировании фрагменты получают путем остановки синтеза ДНК-цепи на разных этапах, при проведении же секвенирования по Максаму- Гилберту фрагменты получают путем ограниченного (только в одном месте по одному основанию) химического разрыва меченых молекул ДНК.

 
 

Рис. 14. Принцип секвенирования ДНК методом химической деградации

По Максаму- Гилберту


Сначала проводят четыре реакции модификации оснований: 1) модификацию аденина; 2) модификацию цитозина; 3) модификацию аденина и гуанина; 4) модификацию тимина и цитозина. Проводимая модификация затрагивает в каждой из всего множества присутствующих цепочек ДНК всего лишь один нуклеотид, благодаря подбору концентраций реагентов и использованию стоп-буферов. После чего по модифицированным основаниям проводят разрыв цепи. Таким образом, в результате четырех типов реакций образуется смесь олигонуклеотидных молекул, различающихся по размеру на один нуклеотид и несущих на одном из концов метку.

Этапы секвенирования путем химической деградации:

1. Мечение одного конца ДНК.

2. Проведение реакций модификации азотистых оснований и расщепление цепи ДНК по модифицированным основаниям.

Диметилсульфат используют для модификации аденина и гуанина, гидролиз по аденину проводится под действием кислой, а потом щелочной рН, гидролиз по гуанину происходит под действием пиперидина.

Гидразин используют для модификации цитозина и тимина в бессолевой среде, а в солевой среде (2М NaCl) только цитозина, расщепление модифицированных оснований происходит по действием пиперидина.

3. Секвенирующий электрофорез, радиоавтография, учет результатов.

4. Анализ информации, закодированной в секвенированном фрагменте.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 657 | Нарушение авторских прав

При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.003 сек.)