АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Генная инженерия — раздел биотехнологии, связанный с целена­правленным конструированием in vitro новых комбинаций генетичес­кого материала, способного размножаться в клетке и синтезиро­вать определенный продукт.

Генная инженерия решает следующие задачи:

1) получение генов путем их синтеза или выделения из кле­
ток;

2) получение рекомбинантных молекул ДНК;

3) клонирование генов или генетических структур;

4) введение в клетку генов или генетических структур и син­
тез чужеродного белка.

Получение генов. Известны два способа искусственного син­теза генов вне организма — химический и ферментативный. Хи­мическим путем в 1969 г. американский ученый Г. Корана с сотр. синтезировали ген аланиновой тРНК дрожжей. Этот ген включал 77 пар нуклеотидов, последовательность которых была

уже ранее расшифрована. Ученые сначала синтезировали фраг­менты ДНК длиной от 5 до 12 нуклеотидов, затем соединили их в определенном порядке при помощи открытого к тому времени фермента лигазы. Однако ген аланиновой тРНК при введении в клетку кишечной палочки или бесклеточную среду не функцио­нировал. Оказалось, что он не имел регуляторных элементов — промотора, где локализована точка инициации синтеза, и терми­нальных кодонов, которые дают сигнал о завершении синтеза иРНК. В 1976 г. Г. Корана с сотр. осуществили синтез гена супрессорной тирозиновой тРНК протяженностью 126 пар нук­леотидов. Были также синтезированы примыкающие к гену регу-ляторные участки: промотор (52 пары нуклеотидов) и термина­тор (21 пара нуклеотидов) и прикрепленные к концам полимера тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА. В этом случае искусственно синтезированный ген, встроенный в геном мутантного фага Т4, при введении в живую кишечную палочку оказался работоспо­собным^ В 1979 г. в нашей стране под руководством Ю. А. Ов­чинникова и М. Н. Колосова химическим путем с помощью ферментов были синтезированы гены гормонов человека и жи­вотных — энкефалина и брадикинина.

Химико-ферментативный синтез довольно широко применя­ют в генной инженерии для получения мелких генов. Для полу­чения генов животных, растений и человека, размер которых составляет 1000—3000 нуклеотидов, этот метод слишком сложен и пока неосуществим. Ученые нашли более простой способ по­лучения таких генов.

В 1970 г. Г. Темин с сотр. обнаружили фермент обратную транскриптазу (ревертазу). В 1972 г. было открыто, что некото­рые онкогенные вирусы при помощи обратной транскриптазы могут синтезировать ДНК, используя в качестве матрицы иРНК. Дальнейшие исследования показали, что матрицами для образо­вания копий ДНК могут служить не только РНК онкогенных вирусов, но и другие иРНК. Это открывало принципиальные возможности ферментативного синтеза любых индивидуальных генов (ДНК), используя их РНК-копии. Под ферментативным синтезом гена имеют в виду транскрибирование комплементар­ной нити ДНК (гена) на молекулах РНК в пробирке. Система для синтеза представляет собой раствор, в котором содержатся все четыре нуклеотида, входящих в состав ДНК, ионы магния, фермент обратная транскриптаза (ее получают из онкогенных вирусов) и матричная (информационная) РНК, кодированная геном, копию которого ставится задача снять. На иРНК обрат­ная транскриптаза синтезирует комплементарную ей цепь ДНК, а затем на ней при помощи этого же фермента синтезируется вторая цепь ДНК. В результате получается ген по структуре такой же, как и тот, на котором была синтезирована иРНК.

Этим способом в лабораториях многих стран создан целый

ряд генов. В нашей стране йод руководством В. А. Энгельгардта был разработан проект «Ревертаза» — программа синтеза генов с помощью этого фермента. В осуществлении проекта участвовали ведущие отечественные и зарубежные институты. В итоге с 1974 по 1978 г. были синтезированы гены глобина голубя, кролика и человека, а также гены митохондрий печени крыс, часть гена, кодирующего иммунные белки мышей, и др.

Гены, синтезированные при помощи обратной транскрипта­зы, не имеют регуляторных участков и функционально неактив­ны. Поэтому транскрибирование копий ДНК рекомендуется проводить с про-мРНК, которые имеют все необходимые копии регуляторных частей гена.

Кроме изложенных способов ген можно получить путем выде­ления с помощью трансдуцирующих фагов. Таким путем в 1969 г. был впервые выделен лактозный ген кишечной палочки. Однако такой способ получения генов не всегда пригоден, так как предусматривает строгие места локализации фагов. Поэтому используются и другие приемы выделения фрагментов ДНК с нужными для переноса генами.

Рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы). Важным собы­тием для развития генной инженерии было открытие в клетках бактерий ферментов, способных разрезать молекулу ДНК в стро­го определенных местах. Ферменты эти называются рестрикти-рующими эндонуклеазами или рестриктазами, а процесс «разреза­ния» молекулы ДНК называется рестрикцией. С рестриктазами связаны дальнейшие успехи в молекулярной биологии. Они стали одним из главных элементов генной инженерии. Участок ДНК, узнаваемый определенной рестриктазой, включает специ­фическую последовательность из 6—8 пар оснований, являющих­ся палиндромом. Палиндромом называется последовательность ДНК, которая считывается одинаково в обоих направлениях, начиная от З'-конца каждой цепи. Например, рестриктаза E.coli под названием EcoRI узнает последовательность

Г I ААТТ Ц

Ц ТТАА t Г

и, прикрепляясь к ней, делает по одному однонитевому надрезу с обеих сторон, т. е. разрезает ее в симметричных участках, указанных стрелками. В результате двухцепочная молекула ДНК, если была кольцевой, вследствие разрыва приобретает линейное строение. На краях молекулы образуются липкие концы, представленные однонитевыми участками из четырех нуклеоти­дов: на одном конце будет последовательность ААТТ, на дру­гом — ТТАА. При наличии липких концов молекула ДНК из линейной формы вновь способна замкнуться в кольцо без до­полнительной обработки. Были обнаружены рестриктазы, узнаю­щие самые разнообразные последовательности нуклеотидов. На­пример, рестриктаза EcoRII узнает последовательность ЦЦТГГ.

К настоящему времени известно свыше 200 рестриктаз, харак­терных для разных видов микроорганизмов. Это открывает новые возможности для экспериментаторов. Огромные молекулы выс­ших организмов включают большое число мест разрезания для ферментов рестрикции. При обработке ДНК рестриктазами обра­зуются многочисленные фрагменты ДНК, в которых представле­ны отдельные гены. Затем гены можно соединять в определенные структуры. Остающиеся в такой структуре разрывы нитей ДНК воссоединяются лигазой. Имеется и другой способ получения фрагментов ДНК с липкими концами. Он состоит в том, что выделенные или искусственно синтезированные участки ДНК об­рабатывают эндонуклеазой, укорачивающей участки ДНК с обоих концов, после чего при помощи фермента полинуклеотидтран-сферазы пристраивают к этим концам последовательности адени-ловых и тимидиловых нуклеотидов. Длина липких поли-А и поли-Т составляет 50—100 нуклеотидов. При встраивании гена в вектор используются оба рассмотренных метода и часто совместно.

Рекйибинантные ДНК. Рекомбинантная ДНК — это искусст­венно полученная молекула ДНК. Она имеет форму кольца, включает ген (гены), составляющий объект генетических манипу­ляций, и так называемый вектор, обеспечивающий размножение рекомбинантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, кодируемого внесенным геном. Векторами являются те компоненты рекомбинантных ДНК, которые способны акцепти­ровать чужеродные гены и обеспечивать их репликацию в клетках хозяина. Векторы должны обладать следующими особенностями: 1) иметь свойства регогакона; 2) нести субстратные участки для рестриктаз, иначе невозможна встройка ДНК; 3) содержать один или несколько маркирующих генов, чтобы по фенотипу можно было определить факт его передачи. Исследования показали, что эффективными векторами являются плазмиды. Из них в качестве векторов используются Col El, pSC 101 и др. Из вирусов в каче­стве векторов используют фаги X, SV 40 и их производные. Векто­ры придают рекомбинантной молекуле способность воспроизво­диться независимо от хромосомы клетки бактерии.

Соединение вектора с фрагментом ДНК может производиться следующими путями: при помощи липких концов, образующихся в ДНК под действием эндонуклеаз рестрикции; дополнительного син­теза полинуклеотидных фрагментов каждой из цепей ДНК (поли-А и поли-Т); соединения тупых концов при помощи Т4-лигазы.

На рисунке 25 показаны ферментативный синтез гена и встраивание его в векторную плазмиду. Слева на иРНК при помощи обратной транскриптазы синтезируется цепь ДНК (кДНК), затем иРНК удаляют щелочью и при помощи ДНК-полимеразы достраивают вторую цепь кДНК, экзонуклеазой уко­рачивают обе цепи ДНК и концевой трансферазой пришивают к их концам поли-Т-последовательности. На этом же рисунке

МРНК

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 769 | Нарушение авторских прав