АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПТАЗА

МРНК

«ДНК

ДНК - ПОЛИМЕРАЗА ДВУХНИТЕВАЯ кДНК

ЭКЗОНУКЛЕАЗА

КОНЦЕВАЯ ТРАНСФЕРАЗА

•АААА

КОНЦЕВАЯ ТРАНСФЕРАЗА

ГИБРИДНАЯ МОЛЕКУЛА СО ВСТРОЕННЫМ ГЕНОМ РАЗРЫВЫ УСТРАНЯЮТСЯ ЛИГАЗОЙ

Рис. 25. Ферментативный синтез гена и встраивание его в векторную плазмиду

(по С. М. Гершензону)

справа показано, что кольцевую ДНК векторной плазмиды раз­резают рестриктазой и превращают ее в линейную форму, затем экзонуклеазой цепи укорачивают и концевой трансферазой при­шивают к ним поли-А-последовательности. На последнем этапе соединяют оба типа молекул ДНК и получают гибридную моле­кулу — векторную плазмиду со встроенным в нее синтезирован­ным геном. Разрывы в цепях ДНК воссоединяют лигазой.

В данном случае было известно, какой ген включен в вектор­ную плазмиду. Но в работах по трансгенозу чаще имеют дело со многими фрагментами ДНК, и среди них только единичные включают ген, который подлежит переносу. Для получения фраг­ментов ДНК с определенным геном применяют так называемый способ дробового ружья, который заключается в том, что ДНК механически или ферментами дробится на множество мелких фрагментов, после чего их вслепую гибридизируют с молекулами ДНК вектора. Перед этим ДНК вектора обрабатывают рестрик­тазой для придания им линейной формы и образования липких концов. После введения рекомбинантных молекул в кишечную палочку при помощи селективных сред выделяют те бактерии, в которые попал фрагмент ДНК с нужным геном. Включенный ген обнаруживают по продукту его действия в виде определенно­го вещества (фермент, гормон и т. д.). Размножение в бактериях

идентичных рекомбинантных ДНК называется клонированием. Каждый клон бактерий содержит свою рекомбинантную ДНК. Разрабатываются методы, позволяющие производить замены нуклеотидов в ДНК клонированного гена и тем самым изменять свойства кодируемого этим геном белка.

Введение в клетку рекомбинантных молекул и синтез чужерод­ного белка. Чаще всего рекомбинантные молекулы вводятся в клетки бактерий методом трансформации. Сначала клетки бакте­рий с целью повышения их способности поглощать плазмидную ДНК обрабатывают хлористым кальцием или хлористым барием. После этого в клеточную взвесь вводят раствор с рекомбинантны-ми молекулами. Некоторые из этих молекул проникают внутрь клетки, и часть из них, прикрепясь к мембранам клетки, начинает размножаться и функционировать (рис. 26).

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 520 | Нарушение авторских прав