АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Серологические (serum — сыворотка крови) реакции при изучении вирусов и диагностике вирусных инфекций приобрета­ют все большее значение

Серологические (serum — сыворотка крови) реакции при изучении вирусов и диагностике вирусных инфекций приобрета­ют все большее значение. В связи с достигнутыми в последние годы успехами в приготовлении высокоочищенных антигенов, иммунных сывороток, совершенствовании самой техники поста­новки серологических реакций повысилась их специфичность и чувствительность. Вскоре после открытия РГА было установлено, что противовирусные сыворотки, соединенные с соответствующим вирусом, способны нейтрализовать его гемагглютинирующую ак­тивность, т.е. задерживать процесс гемагглютинации. Одной из простейших серологических реакций является реакция задержки (РЗГА) или торможения (РТГА) гемагглютинации.

РЗГА (РТГА) — высокоспецифическая серологическая реак­ция, позволяющая решить следующие задачи: определить титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифи­цировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известней сыворотке; установить степень антигенного родства двух гемагглютинирующих вирусов. РЗГА широко используют для ретро­спективной диагностики некоторых вирусных инфекций (грипп, парагрипп КРС, вирусный аборт овец и др.). Для этого использу­ют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 2...3 недели, и по приросту титра антител в 4 и более раз определяют заболева­ние.

Достоинства РЗГА: простота техники постановки, быстрота ответа, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевиз­на. Недостаток — РЗГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Сущность РЗГА заключается в том, что при взаимодействии противовирусной иммунной сыворотки с соответствующими штаммами вируса происходит задержка (торможение) гемагглютинирующей способности вируса. На результат РЗГА влияют неспецифические ингибиторы гемагглютинации, содержащиеся в сыворотках крови. Они обла­дают способностью вступать в связь с вирусами и тормозить гемагглютинацию. С целью ликвидации отрицательного влияния ингибиторов на ход реакции их необходимо разрушить (удалить). Для этого используют несколько методов.

1. Простейшим является метод освобождения сывороток от неспецифических ингибиторов с помощью CO₂. С этой целью к одному объему сыворотки добавляют 9 объемов дистиллированной воды. Пропускание углекислоты через цельные или разведенные физиологическим или гипотоническим растворами сыворотки не дает части ингибиторов выпасть в осадок. CO₂ пропускают в течение 5...7 мин из аппарата Киппа до интенсивного помутнения сыворотки. Вместо газообразной углекислоты можно использовать кусочки сухого льда размером с горошину, которые вносят в про­бирку с небольшим интервалом, чтобы избежать пенообразования; для освобождения от образовавшихся хлопьев мукополисахаридов, содержащих неспецифические ингибиторы, пробирки с сыво­роткой центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 10...20 мин, надосадочную жидкость отсасывают и для восстанов­ления физиологической концентрации соли добавляют 8,5%-ный раствор натрия хлорида (1:10 объема). Сыворотки, обработанные углекислотой, не требуют прогревания, так как они освобождают­ся от термостабильных и термолабильных ингибиторов одновре­менно. Обработка сывороток CO₂ практически не снижает титр специфических антигемагглютининов.

2. Разрушение ингибиторов фильтратом холерного вибрио­на. К 1 объему прогретой при 56°С в течение 30 мин сыво­ротки добавляют 4 объема фильтрата холерного вибриона и смесь инкубируют в течение 18...20 ч при 37 °С. После этого сы­воротку вновь прогревают 1 ч при 56 °С. Обработанная таким об­разом сыворотка считается разведенной 1:5.

3. Удаление ингибиторов каолином. К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,8 мл физиологического раствора, прогревают при 56 °С в течение 30 мин и добавляют 1 мл 25%-ной взвеси каолина на физиологическом растворе. Смесь встряхивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем центрифу­гируют 10-20 мин при 2000 об/мин. После обработки сыворотка разведена 1:10. Удаление ингибиторов с помощью каолина можно изменить, обрабатывая сыворотку непосредственно в панелях для микротит­рования. Для этого в 1-ый ряд лунок вносят предварительно про­гретые исследуемые сыворотки в объеме 0,02 мл 3 добавляют к ним 0,18 мл 12,5%-ной суспензии каолина. После встряхивания и центрифугирования пластины на специальной центрифуге осуще­ствляют двукратные разведения абсорбированной сыворотки пу­тем переноса петлей из лунки в лунку.

4. Разрушение ингибиторов периодатом калия. Готовят 0,05 М раствор периодата калия на дистиллированной воде. Для этого 1,15 г периодата калия (KJ0₄) растворяют в 100 мл дистил­лированной воды при подогревании в водяной бане (70...80 °С) в течение 2...5 мин до получения прозрачного раствора. Для разру­шения ингибиторов к одному объему неразведенной предвари­тельно прогретой при 56 °С в течение 30 мин сыворотки крови добавляют один объем раствора периодата калия. Смесь оставля­ют при комнатной температуре на 2 ч, затем добавляют два объе­ма 5%-ного раствора глюкозы для нейтрализации действия пе­риодата калия (сыворотка разведена 1:4).

КомпонентыРЗГА: 1-й вариант постановки — исследуемый вируссодержащий материал; диагностическая иммунная сыворот­ка; 1%-ная взвесь эритроцитов; 2-й вариант— исследуемая сыво­ротка крови; стандартный антиген (вирусный диагностикум); 1%-ная взвесь эритроцитов.

Постановка РЗГА включает следующие этапы: оп­ределение рабочей дозы вируса (1 ГАЕ), определение правильно­сти выбора 4 ГАЕ и проведение основного опыта РЗГА. Вначале в РГА определяют 1 ГАЕ, а для основного опыта используют от 2 до 8 ГАЕ, чаще всего 4 ГАЕ. Например, если 1 ГАЕ вируса соответствует разведению 1:160, то при подготовке рабочей дозы (4 ГАЕ) вирус разводят 1:40. Вирус в рабочем разве­дении готовят в объеме, необходимом для проведения основного опыта. Для приготовления рабочего разведения 1:40 берут 1 мл исходного вируса и 39 мл физиологического раствора. Правиль­ность приготовления рабочей дозы (4 ГАЕ) определяют в дополни­тельном опыте. Для этого используют пластмассовую панель. В лунки панели, начиная со второй и включая шестую (контроль), вносят по 0,1 мл физраствора. Затем в первую лунку вносят 0,1 мл вируссодержащего материала (4 ГАЕ) и делают последова­тельные переносы. Из пятой лунки 0,1 мл выливают в дезраствор, в контрольную вирус не добавляют. Получают разведения вирус­содержащего материала в 4 ГАЕ, 2 ГАЕ, 1 ГАЕ, 0,5 ГАЕ и 0,25 ГАЕ. Затем в каждую лунку, в том числе и контрольную, вносят по 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур. Реакцию остав­ляют при комнатной температуре на 45...50 мин и проводят учет (табл.7). При правильном выборе 4 ГАЕ в первых двух лунках — агглютинация эритроцитов на 3+, в третьей (1 ГАЕ) — 2+, в кон­троле агглютинация отсутствует.

Таблица 7

Проверка правильности выбора 4 ГАЕ

Основной опыт РЗГА (для определения антител в исследуе­мой сыворотке). В лунки пластмассовой панели разливают по 0,1 мл физиологического раствора. Затем в первую лунку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и делают последовательные ее пе­реносы. Из последней лунки 0,1 мл разведенной сыворотки выли­вают в дезраствор. Таким образом, получают разведения иссле­дуемой сыворотки от 1:2 до 1:256. В каждую лунку вносят по 0,1 мл вируссодержащего материала в 4 ГАЕ и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. По истечении этого времени в каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур и снова оставляют при комнатной температуре.

Одновременно ставят контроли: а) контроль сыворотки (0,1 мл разведенной 1:10 сыворотки крови и 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур);

б) контроль эритроцитов (0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур и 0,1 мл физраствора);

в) контроль вируса (0,1 мл антигена в 4 ГАЕ и 0,1 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур).

Панели встряхивают и после 30...60 мин контакта учитыва­ют реакцию (табл.8).

Таблица 8

Основной опыт РЗГА для определения антител

Учет результатов начинают с контролей. Они должны пока­зать результат, отраженный в табл.8. При наличии соответст­вующих антител в исследуемых сыворотках происходит нейтра­лизация гемагглютинирующей активности вируса и задержка аг­глютинации эритроцитов. В первых лунках наблюдают положи­тельную РЗГА: эритроциты оседают на дно лунки в виде ком­пактной точки. В последующих лунках, где имеет место сниже­ние титра антител, отмечают отрицательную РЗГА — агглютинация эритроцитов на 1,2 и 3 плюса. В 1-ом и 2-ом контролях агглютинация должна отсутствовать, а в 3-ем — агглюти­нация эритроцитов должна быть не менее, чем на 3 плюса.

РЗГА позволяет не только выявить специфические антите­ла, но и определить их титр. Титром антител в РЗГА называют наименьшее их количество, способное полностью задержать гемагглютинацию. В нашем примере (табл.8) титр антител состав­ляет 1:32.

Реакция задержки гемадсорбции (РЗГад).