АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Реакция нейтрализации широко используется в вирусоло­гической практике

Реакция нейтрализации широко используется в вирусоло­гической практике. Она предназначена для идентификации выде­ленного вируса, определения наличия антител и изменения их титра в сыворотке крови больных и переболевших животных, ус­тановления количественного содержания антител в лечебных, профилактических и диагностических препаратах (гамма-глобулины, диагностические сыворотки).

Сущность реакции нейтрализации заключается в способно­сти вируснейтрализующих антител иммунных сывороток подав­лять инфекционные свойства вируса. В результате этого вирус утрачивает способность размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения в чувствительной к нему биологической системе (культура клеток, развирающийся куриный эмбрион, организм восприимчивого лабораторного животного).

Достоинствами реакции нейтрализация являются ее универ­сальность и высокая специфичность. К недостаткам относятся: высокая трудоемкость, необходимость строгого соблюдения сте­рильности материалов и инструментов, высокая стоимость тест-объектов, необходимость проведения математических расчетов, относительная длительность при постановке реакции. На результаты РН, особенно на их достоверность и воспро­изводимость, оказывают влияние ряд факторов: методика поста­новки реакции, способ и правильность ее учета, концентрация используемых сывороток и вирусов, метод разведения компонен­тов реакции и др. Вируснейтрализующие антитела накапливаются в организме в период выздоровления (реконвалесценции) и остаются в нем длительное время. Оптимальные сроки для обнаружения антител в каждом случае различны и зависят от особенностей иммунитета при той или иной инфекции. Например, при гриппе свиней мак­симальный титр вируснейтрализующих антител регистрируется между 14 и 27-м днями и снижается к 6 месяцам. При лейкозе птиц антитела выявляются спустя 4 недели после заражения и сохраняются в течение всей жизни.

Сыворотки, применяемые в РН, должны быть предвари­тельно освобождены от термолабильных ингибиторов. Для этого их прогревают при разведении не менее чем в два раза в течение 30 мин при 56 °С. Однако, антитела к некоторым вирусам (парагриппа, респираторно-синцитиальной инфекции) чувствительны к прогреванию, поэтому при постановке РН с такими сыворотками его следует избегать.

При хранении сывороток титр антител постепенно снижает­ся. Долго хранившиеся сыворотки активизируют добавлением к ним 1/10 объема комплемента, увеличивающего авидность анти­тел. Вируснейтрализующие антитела хорошо сохраняются в лиофильно высушенном или замороженном состоянии (-20 °С).

Для разведения вирусов при постановке РН на лаборатор­ных животных или в куриных эмбрионах используют фосфатно-буферный раствор (рН 7,0... 7,2). При работе с культурами клеток используют ту среду, которую применяют в качестве поддержи­вающей для данного вида клеток (среда 199, 2,5...5%-ный гемогидролизат и др.). Не следует применять раствор обычного изотонического хлорида натрия, поскольку в нем быстро инактивируются многие вирусы.

В зависимости от цели исследования применяют два вариан­та постановки РН: 1 — для идентификации и определения титра вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови (в данном случае соединяют равные объемы разных разведения сыворотки с постоянной дозой вируса); 2 — для идентификации и изучения неизвестного вируса (соединяют равные количества одного и того же разведения сыворотки с убывающими дозами ви­руса). Результаты реакции как в первом, так и во втором вариан­тах определяют о использованием лабораторных животных, РКЭ и культур клеток.

Компонентами реакции в 1-м варианте постановки РН являются: исследуемая сыворотка, стандартный вирусный анти­ген, тест-объект, для контрольной реакции — диагностическая и нормальная сыворотки крови. Реакцию ставят в два этапа: пер­вый этап — определение титра вируса; второй — постановка ос­новного опыта РН в этом варианте.

Для определения титра вируса готовят 10-кратные разве­дения вируссодержащего материала, обычно с 10-¹ до 10-⁹, так как его титр редко превышает указанную величину. Берут 9 сте­рильных пробирок и в каждую из них вносят по 4,5 мл фосфатно-буферного раствора. Затем в первую добавляют 0,5 мл вируссодержащего материала (разведение 1:10 или 10-¹), смесь перемешивают и 0,5 мл переносят во вторую пробирку (разведение 1:100 или 10-²). Из второй — 0,5 мл — в третья (10-³) и т.д., пользуясь при этом всякий раз чистой пипеткой. Каждым разведением ви­руссодержащего материала заражают лабораторных животных (4 гол.). Объем вводимого материала зависит от метода зараже­ния, который связывают с тропизмом вируса. Например, при за­ражении нейротропным вирусом исследуемый материал вводят в мозг, пневмотропным — через нос, дерматропным — на скарифи­цированную кожу или внутрикожно и т.д. За животными наблю­дают в течение 3...30 дней и более, в зависимости от возраста и вида животного и др. факторов. Наибольшее разведение вируса, обеспечивающее гибель половины (50%) зараженных животных, принимают за титр вируса, обозначаемого в данном случае симво­лом ЛД₅₀ (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Допустим, вирус в разведении 10⁴ вызвал гибель 50% животных, это разведение и будет соответствовать 1 ЛД5о.Следовательно, 100 ЛД₅₀ будет соответствовать разведению 10² (1:100). Это разведение чаще всего используют.

Аналогично определяют титр вируса на РКЭ по их гибели (ЭЛД ₅₀ — эмбриональная летальная доза) или по патологоанатомическим изменениям (ЭИД ₅₀ — эмбрионинфицирующая доза) в культуре клеток по цитопатическому действию (1 ТЦД₅₀ — тка­невая цитопатическая доза).

Постановка реакции. После установления титра вируса го­товят двукратные разведения исследуемой сыворотки, начиная с 1:2 до 1:128 и более, в зависимости от предполагаемого титра ви­руснейтрализующих антител, в объеме 0,5 мл и к каждому разве­дению сыворотки добавляют по 0,5 мл вируссодержащего мате­риала в разведении, соответствующем 100 ЛД_5о- Одновременно ставят контроли:

а) контроль вируса (100 ЛД₅₀ вируссодержащего материала соединяют с физиологическим раствором в равных объемах);

б) контроль иммунной сыворотки (иммунную сыворотку в рабочем титре соединяют с вируссодержащим материалом в равных объемах);

в) контроль нормальной сыворотки (нормальную сыворотку соединяют с 100 ЛД5о вируса в равных объемах),

Пробирки встряхивают и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 30...60 мин. Смесью из каждой пробирки, в том числе и из контрольных, заражают чувствительных лабораторных животных (4 гол.). Идентификацию вируснейтрализующих анти­тел с применением данного тестобъекта проводят при диагности­ке ящура, бешенства, лейкоза птиц. Объем и место введения сме­си те же, что были выбраны при определении 1 ЛД5о- Сроки наблюдения за животными аналогичны вышеуказанным.

Учет результатов. Вначале учитывают результаты контро­лей. В первом и третьем из них животные должны погибнуть, во втором— остаться в живых. Если исследуемая сыворотка содер­жит антитела, то они будут нейтрализовать патогенное действие вируса и животное не погибает. Однако, сыворотку используют в разведениях, и, в связи с этим, в определенной пробирке антител окажется недостаточно для нейтрализации вируса. Процент гибе­ли животных будет нарастать в направлении большего разведе­ния. Все это дает возможность определить титр вируснейтрали­зующих антител, который рассчитывается по методам Рида и Менча или Кербера. За титр антител исследуемой сыворотки при­нимают то разведение, которое предотвращает гибель 50% лабо­раторных животных от действия 100 ЛД5о вируса (табл.10). При использовании РКЭ результат РН учитывают по спо­собности вируснейтрализующих антител сыворотки предотвра­щать гибель эмбрионов, появление фокусов поражения на хорионаллантоисе и снижать титр вирусных гемагглютининов у 50% куриных эмбрионов. Эти методы применимы при определении ней­трализующей активности сывороток по отношению к вирусам гриппа, оспы, болезни Ньюкасла, инфекционного ларинготрахеита и бронхита кур.

Результат РН в культуре клеток оценивают по способности вируснейтрализующих антител исследуемой сыворотки в определенных разведениях предотвращать развитие цитопатогенного эффекта (ЦПЭ), что используется при диагностике болезни Ayeски, ринопневмонии лошадей, вирусного гастроэнтерита свиней, болезни Тешена, лейкоза птиц и др. По торможению феномена гемадсорбции к зараженным вирусом клеткам эритроцитов курицы, человека, морской свинки диагностируют грипп и парагрипп.

Таблица 10

Схема постановки реакции нейтрализации (определение антител на белых мышах)

Титр антитела = 1:64

Компонентами реакции во 2-м варианте постановки слу­жат: исследуемый вируссодержащий материал, диагностическая (известная), нормальная (отрицательная) и исследуемая сыворот­ки крови, тест-объект. Этот вариант позволяет идентифицировать исследуемый вирус и определить индекс нейтрализации (ИН) спе­цифических и исследуемых сывороток.

Для постановка РН готовят постоянные разведения специ­фической и нормальной сывороток (обычно 1:10) и три ряда 10-кратно убывающих разведении вируса по 0,5 мл. Последнее раз­ведение вируса, взятого в опыт, должно превышать его биологи­ческий титр, так как в противном случае будет невозможно рас­считать индекс нейтрализации: например, если титр вируса 10⁷ ЕД5о> то в опыт следует брать вирус до разведения 10-8 В пробирки первого ряда добавляют специфическую сыворотку (1:10) по 0,5 мл, во второй ряд — нормальную сыворотку по 0,5 мл, в третий — физиологический раствор по 0,5 мл. Объем сыворотки и вируса должен быть одинаковым. Пробирки встря­хивают и оставляют на контакт. Продолжительность этого перио­да и температуру варьируют в зависимости от вируса, с которым проводится работа. После инкубации смесь сыворотки с разведениями вируса в объеме по 0,2 мл вводят в чувствительную тест-систему, начиная с разведения 10-⁸. Затем проводят учет реакции (табл.11).

Таблица 11.

Схема реакции нейтрализации для идентификации вируса

Учет реакции. Если происходит нейтрализация вируса (нет изменений в чувствительном объекте), значит, антитела диагно­стической сыворотки специфичны исследуемому вирусу. Все это дает возможность определить вид вируса.

При учете результатов РН по этому варианту пользуются Е методом определения индекса нейтрализации по Риду и Менчу. Индекс нейтрализации представляет собой от­ношение дозы вируса в смеси с нормальной сывороткой, вызы­вающей изменения у 50% чувствительных объектов, к дозе вируса, вызывающей те же изменения в смеси с иммунной сывороткой. Или, другими словами, это число, показывающее, во сколько раз специфическая сыворотка снижает титр вируса по сравнению с нормальной. В нашем примере (табл.11):

ИН = Т ₁/ Т ₂ = 10⁷ / 10² = 10⁵

где Т₁ — титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Tg — титр вируса в присутствии специфической сыворотки.

Индекс нейтрализации до 10 указывает на отсутствие вируснейтрализующих антител в сыворотке, от 11 до 49 считается сомнительным, а 50 и выше — положительным.

В настоящее время существуют различные модификации проведения РН. Приведем некоторые из них.

Микрометод РН. Применяется при диагностике везикуляр­ного стоматита, гриппа, парагриппа, аденовирусных инфекций. При данном методе используют пластмассовые пластины, в лун­ках которых выращивают соответствующую культуру клеток (ПЭС, ФЭК, СПЭВ, ТБ). Затем в лунки вносят двукратные разве­дения испытуемой сыворотки, соединенные с суспензией вируса в концентрации100 ТКИД50 (тканевая инфицирующая доза) и че­рез 4...7 суток инкубации оценивают выраженность цитопатического действия вирусов. Данный метод позволяет значительно снизить расходы исследуемых сывороток и вирусного диагности­ческого материала, одновременно исследовать большое количество образцов сывороток.

Цветная проба. Суть этой реакции заключается в способно­сти вируса подавлять обменные процессы в зараженных клетках культуры ткани. Клеточные суспензии с определенной концен­трацией клеток добавляют в пробирку или в лунки пластмассо­вых пластин через час после внесения в них смеси вируса с опре­деленными разведениями сыворотки. Цветная проба основана на том, что клетки, размножаясь в незараженных пробирках или пробирках со смесью вируса и нейтрализовавших его антител, об­разуют много кислых продуктов обмена, которые снижают рН питательной среды. Это легко обнаруживают благодаря включен­ному в состав среды индикаторному красителю (например, фено­ловому красному), цвет которого меняется в зависимости от рН среды. Красный цвет при рН 7,4.-7,8 становится оранжевым при рН 7,2, а при снижении рН ниже 7,0 — желтым. При гибели кле­ток под воздействием вируса не наблюдается выделения достаточ­ного количества кислых продуктов, поэтому среда остается крас­ной. Титр вируснейтрализующих антител определяют как последнее разведение сыворотки, которое в присутствии добав­ленного вируса позволило клеткам сохранить нормальные обмен­ные процессы, а следовательно, и снизить рН среди до того же уровня, что и в незараженной контрольной культуре. Обычно цветную пробу широко используют при работе с энтеро- и аденовирусами животных, а также вирусами птиц (болезни Ньюкасла, инфекционного бурсита, инфекционного синовита сухожилий, болезни Марека, инфекционного бронхита птиц, герпеса индеек).

Метод супернейтрализации. Данный метод используется для более точного количественного выявления содержащихся в сыворотках антител. Он основан на повторном добавлении инди­каторного вируса, использованного при первоначальной постанов­ке РН, ко всем пробам сывороток, нейтрализовавшим вирус на первом этапе. В результате вновь возникает реакция взаимодейст­вия между вирусом и избыточным количеством антител. В пробах с более низким содержанием антител эта нейтрализация не про­исходит или будет частичной, в результате чего проявится ЦПД вируса на клетки. В пробах с избытком антител ЦПД будет вновь отсутствовать из-за полной нейтрализации вируса этими антите­лами.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 755 | Нарушение авторских прав