АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Реакция нейтрализации широко используется в вирусоло­гической практике

Прочитайте:
  1. II. Сведения о работах, на выполнение которых осуществляется закупка,
  2. А. Общие сведения по внутрибольничной инфекции.
  3. Анатомо-физиологические сведения о прямой кишке. Классификация заболеваний. Методы обследования больных.
  4. Анатомо-физиологические сведения о щитовидной железе. Классификация заболеваний. Методы исследования щитовидной железы. Профилактика.
  5. Вопрос 1: Местная анестезия: общие сведения, показания и противопоказания к проведению местной анестезии, способы местной анестезии.
  6. Вопрос 1: Отморожение: определение понятия, общие сведения.
  7. Вопрос 1: Сепсис: определение понятия, общие сведения.
  8. Вопрос 5: Влажная (гнилостная) гангрена: общие сведения, этиопатогенез, клиника, лечение.
  9. Вопрос 7: Пролежни: общие сведения, этиопатогенез, клиника, лечение, профилактика.
  10. Вопрос 8: Язва: общие сведения, этиопатогенез, классификация, осложнения, лечение.

Реакция нейтрализации широко используется в вирусоло­гической практике. Она предназначена для идентификации выде­ленного вируса, определения наличия антител и изменения их титра в сыворотке крови больных и переболевших животных, ус­тановления количественного содержания антител в лечебных, профилактических и диагностических препаратах (гамма-глобулины, диагностические сыворотки).

Сущность реакции нейтрализации заключается в способно­сти вируснейтрализующих антител иммунных сывороток подав­лять инфекционные свойства вируса. В результате этого вирус утрачивает способность размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения в чувствительной к нему биологической системе (культура клеток, развирающийся куриный эмбрион, организм восприимчивого лабораторного животного).

Достоинствами реакции нейтрализация являются ее универ­сальность и высокая специфичность. К недостаткам относятся: высокая трудоемкость, необходимость строгого соблюдения сте­рильности материалов и инструментов, высокая стоимость тест-объектов, необходимость проведения математических расчетов, относительная длительность при постановке реакции. На результаты РН, особенно на их достоверность и воспро­изводимость, оказывают влияние ряд факторов: методика поста­новки реакции, способ и правильность ее учета, концентрация используемых сывороток и вирусов, метод разведения компонен­тов реакции и др. Вируснейтрализующие антитела накапливаются в организме в период выздоровления (реконвалесценции) и остаются в нем длительное время. Оптимальные сроки для обнаружения антител в каждом случае различны и зависят от особенностей иммунитета при той или иной инфекции. Например, при гриппе свиней мак­симальный титр вируснейтрализующих антител регистрируется между 14 и 27-м днями и снижается к 6 месяцам. При лейкозе птиц антитела выявляются спустя 4 недели после заражения и сохраняются в течение всей жизни.

Сыворотки, применяемые в РН, должны быть предвари­тельно освобождены от термолабильных ингибиторов. Для этого их прогревают при разведении не менее чем в два раза в течение 30 мин при 56 °С. Однако, антитела к некоторым вирусам (парагриппа, респираторно-синцитиальной инфекции) чувствительны к прогреванию, поэтому при постановке РН с такими сыворотками его следует избегать.

При хранении сывороток титр антител постепенно снижает­ся. Долго хранившиеся сыворотки активизируют добавлением к ним 1/10 объема комплемента, увеличивающего авидность анти­тел. Вируснейтрализующие антитела хорошо сохраняются в лиофильно высушенном или замороженном состоянии (-20 °С).

Для разведения вирусов при постановке РН на лаборатор­ных животных или в куриных эмбрионах используют фосфатно-буферный раствор (рН 7,0... 7,2). При работе с культурами клеток используют ту среду, которую применяют в качестве поддержи­вающей для данного вида клеток (среда 199, 2,5...5%-ный гемогидролизат и др.). Не следует применять раствор обычного изотонического хлорида натрия, поскольку в нем быстро инактивируются многие вирусы.

В зависимости от цели исследования применяют два вариан­та постановки РН: 1 — для идентификации и определения титра вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови (в данном случае соединяют равные объемы разных разведения сыворотки с постоянной дозой вируса); 2 — для идентификации и изучения неизвестного вируса (соединяют равные количества одного и того же разведения сыворотки с убывающими дозами ви­руса). Результаты реакции как в первом, так и во втором вариан­тах определяют о использованием лабораторных животных, РКЭ и культур клеток.

Компонентами реакции в 1-м варианте постановки РН являются: исследуемая сыворотка, стандартный вирусный анти­ген, тест-объект, для контрольной реакции — диагностическая и нормальная сыворотки крови. Реакцию ставят в два этапа: пер­вый этап — определение титра вируса; второй — постановка ос­новного опыта РН в этом варианте.

Для определения титра вируса готовят 10-кратные разве­дения вируссодержащего материала, обычно с 10-1 до 10-9, так как его титр редко превышает указанную величину. Берут 9 сте­рильных пробирок и в каждую из них вносят по 4,5 мл фосфатно-буферного раствора. Затем в первую добавляют 0,5 мл вируссодержащего материала (разведение 1:10 или 10-1), смесь перемешивают и 0,5 мл переносят во вторую пробирку (разведение 1:100 или 10-2). Из второй — 0,5 мл — в третья (10-3) и т.д., пользуясь при этом всякий раз чистой пипеткой. Каждым разведением ви­руссодержащего материала заражают лабораторных животных (4 гол.). Объем вводимого материала зависит от метода зараже­ния, который связывают с тропизмом вируса. Например, при за­ражении нейротропным вирусом исследуемый материал вводят в мозг, пневмотропным — через нос, дерматропным — на скарифи­цированную кожу или внутрикожно и т.д. За животными наблю­дают в течение 3...30 дней и более, в зависимости от возраста и вида животного и др. факторов. Наибольшее разведение вируса, обеспечивающее гибель половины (50%) зараженных животных, принимают за титр вируса, обозначаемого в данном случае симво­лом ЛД50 (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Допустим, вирус в разведении 104 вызвал гибель 50% животных, это разведение и будет соответствовать 1 ЛД5о.Следовательно, 100 ЛД50 будет соответствовать разведению 102 (1:100). Это разведение чаще всего используют.

Аналогично определяют титр вируса на РКЭ по их гибели (ЭЛД 50 эмбриональная летальная доза) или по патологоанатомическим изменениям (ЭИД 50 эмбрионинфицирующая доза) в культуре клеток по цитопатическому действию (1 ТЦД50 — тка­невая цитопатическая доза).

Постановка реакции. После установления титра вируса го­товят двукратные разведения исследуемой сыворотки, начиная с 1:2 до 1:128 и более, в зависимости от предполагаемого титра ви­руснейтрализующих антител, в объеме 0,5 мл и к каждому разве­дению сыворотки добавляют по 0,5 мл вируссодержащего мате­риала в разведении, соответствующем 100 ЛД- Одновременно ставят контроли:

а) контроль вируса (100 ЛД50 вируссодержащего материала соединяют с физиологическим раствором в равных объемах);

б) контроль иммунной сыворотки (иммунную сыворотку в рабочем титре соединяют с вируссодержащим материалом в равных объемах);

в) контроль нормальной сыворотки (нормальную сыворотку соединяют с 100 ЛД5о вируса в равных объемах),

Пробирки встряхивают и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 30...60 мин. Смесью из каждой пробирки, в том числе и из контрольных, заражают чувствительных лабораторных животных (4 гол.). Идентификацию вируснейтрализующих анти­тел с применением данного тестобъекта проводят при диагности­ке ящура, бешенства, лейкоза птиц. Объем и место введения сме­си те же, что были выбраны при определении 1 ЛД5о- Сроки наблюдения за животными аналогичны вышеуказанным.

Учет результатов. Вначале учитывают результаты контро­лей. В первом и третьем из них животные должны погибнуть, во втором— остаться в живых. Если исследуемая сыворотка содер­жит антитела, то они будут нейтрализовать патогенное действие вируса и животное не погибает. Однако, сыворотку используют в разведениях, и, в связи с этим, в определенной пробирке антител окажется недостаточно для нейтрализации вируса. Процент гибе­ли животных будет нарастать в направлении большего разведе­ния. Все это дает возможность определить титр вируснейтрали­зующих антител, который рассчитывается по методам Рида и Менча или Кербера. За титр антител исследуемой сыворотки при­нимают то разведение, которое предотвращает гибель 50% лабо­раторных животных от действия 100 ЛД5о вируса (табл.10). При использовании РКЭ результат РН учитывают по спо­собности вируснейтрализующих антител сыворотки предотвра­щать гибель эмбрионов, появление фокусов поражения на хорионаллантоисе и снижать титр вирусных гемагглютининов у 50% куриных эмбрионов. Эти методы применимы при определении ней­трализующей активности сывороток по отношению к вирусам гриппа, оспы, болезни Ньюкасла, инфекционного ларинготрахеита и бронхита кур.

Результат РН в культуре клеток оценивают по способности вируснейтрализующих антител исследуемой сыворотки в определенных разведениях предотвращать развитие цитопатогенного эффекта (ЦПЭ), что используется при диагностике болезни Ayeски, ринопневмонии лошадей, вирусного гастроэнтерита свиней, болезни Тешена, лейкоза птиц и др. По торможению феномена гемадсорбции к зараженным вирусом клеткам эритроцитов курицы, человека, морской свинки диагностируют грипп и парагрипп.

Таблица 10

Схема постановки реакции нейтрализации (определение антител на белых мышах)

Компоненты Номера лунок Контроли
                вируса Имунная сыворотка Нор-ная сыв-ка
Ф-Б раствор 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5    
Исследуемая сыворотка 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 в дез раствор     0,5 0,5
Получаемые разведения 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256      
Вирус в 100 ЛД50 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 в дез раствор 0,5   0,5 0,5
Экспозиция 20 мин при комнатной температуре
Заражения мышей 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Экспозиция 30...60 мин при комнатной температуре. Выжило/ погибло
Учет рез-ов 4/0 4/0 4/0 3/1 3/1 2/2 1/3 0/4 0/4 4/0 0/4
                         

Титр антитела = 1:64

Компонентами реакции во 2-м варианте постановки слу­жат: исследуемый вируссодержащий материал, диагностическая (известная), нормальная (отрицательная) и исследуемая сыворот­ки крови, тест-объект. Этот вариант позволяет идентифицировать исследуемый вирус и определить индекс нейтрализации (ИН) спе­цифических и исследуемых сывороток.

Для постановка РН готовят постоянные разведения специ­фической и нормальной сывороток (обычно 1:10) и три ряда 10-кратно убывающих разведении вируса по 0,5 мл. Последнее раз­ведение вируса, взятого в опыт, должно превышать его биологи­ческий титр, так как в противном случае будет невозможно рас­считать индекс нейтрализации: например, если титр вируса 107 ЕД5о> то в опыт следует брать вирус до разведения 10-8 В пробирки первого ряда добавляют специфическую сыворотку (1:10) по 0,5 мл, во второй ряд — нормальную сыворотку по 0,5 мл, в третий — физиологический раствор по 0,5 мл. Объем сыворотки и вируса должен быть одинаковым. Пробирки встря­хивают и оставляют на контакт. Продолжительность этого перио­да и температуру варьируют в зависимости от вируса, с которым проводится работа. После инкубации смесь сыворотки с разведениями вируса в объеме по 0,2 мл вводят в чувствительную тест-систему, начиная с разведения 10-8. Затем проводят учет реакции (табл.11).

Таблица 11.

Схема реакции нейтрализации для идентификации вируса

Компо­ненты Разведение вируса Контроль сыворотток 1:10 Титр вируса, lg Индекс нейтрализа-ции, lg
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
Специфи­ческая сыворотка 1:10 + + - - - - - - -    
+ + - - - - - - -
+_ - - - - - - - -
+ - - - - - - - -
Нормаль­ная сыво­ротка 1:10 + + + + + + + - -   -
+ + + + + + + - -
+ + + + + + - - -
+ + + + + + - - -
Физиоло­гический раствор + + + + + + + - -   -
+ + + + + + + - -
+ + + + + + - - -
+ + + + + + - - -

Учет реакции. Если происходит нейтрализация вируса (нет изменений в чувствительном объекте), значит, антитела диагно­стической сыворотки специфичны исследуемому вирусу. Все это дает возможность определить вид вируса.

При учете результатов РН по этому варианту пользуются Е методом определения индекса нейтрализации по Риду и Менчу. Индекс нейтрализации представляет собой от­ношение дозы вируса в смеси с нормальной сывороткой, вызы­вающей изменения у 50% чувствительных объектов, к дозе вируса, вызывающей те же изменения в смеси с иммунной сывороткой. Или, другими словами, это число, показывающее, во сколько раз специфическая сыворотка снижает титр вируса по сравнению с нормальной. В нашем примере (табл.11):

ИН = Т 1/ Т 2 = 107 / 102 = 105

где Т1 — титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Tg — титр вируса в присутствии специфической сыворотки.

Индекс нейтрализации до 10 указывает на отсутствие вируснейтрализующих антител в сыворотке, от 11 до 49 считается сомнительным, а 50 и выше — положительным.

В настоящее время существуют различные модификации проведения РН. Приведем некоторые из них.

Микрометод РН. Применяется при диагностике везикуляр­ного стоматита, гриппа, парагриппа, аденовирусных инфекций. При данном методе используют пластмассовые пластины, в лун­ках которых выращивают соответствующую культуру клеток (ПЭС, ФЭК, СПЭВ, ТБ). Затем в лунки вносят двукратные разве­дения испытуемой сыворотки, соединенные с суспензией вируса в концентрации100 ТКИД50 (тканевая инфицирующая доза) и че­рез 4...7 суток инкубации оценивают выраженность цитопатического действия вирусов. Данный метод позволяет значительно снизить расходы исследуемых сывороток и вирусного диагности­ческого материала, одновременно исследовать большое количество образцов сывороток.

Цветная проба. Суть этой реакции заключается в способно­сти вируса подавлять обменные процессы в зараженных клетках культуры ткани. Клеточные суспензии с определенной концен­трацией клеток добавляют в пробирку или в лунки пластмассо­вых пластин через час после внесения в них смеси вируса с опре­деленными разведениями сыворотки. Цветная проба основана на том, что клетки, размножаясь в незараженных пробирках или пробирках со смесью вируса и нейтрализовавших его антител, об­разуют много кислых продуктов обмена, которые снижают рН питательной среды. Это легко обнаруживают благодаря включен­ному в состав среды индикаторному красителю (например, фено­ловому красному), цвет которого меняется в зависимости от рН среды. Красный цвет при рН 7,4.-7,8 становится оранжевым при рН 7,2, а при снижении рН ниже 7,0 — желтым. При гибели кле­ток под воздействием вируса не наблюдается выделения достаточ­ного количества кислых продуктов, поэтому среда остается крас­ной. Титр вируснейтрализующих антител определяют как последнее разведение сыворотки, которое в присутствии добав­ленного вируса позволило клеткам сохранить нормальные обмен­ные процессы, а следовательно, и снизить рН среди до того же уровня, что и в незараженной контрольной культуре. Обычно цветную пробу широко используют при работе с энтеро- и аденовирусами животных, а также вирусами птиц (болезни Ньюкасла, инфекционного бурсита, инфекционного синовита сухожилий, болезни Марека, инфекционного бронхита птиц, герпеса индеек).

Метод супернейтрализации. Данный метод используется для более точного количественного выявления содержащихся в сыворотках антител. Он основан на повторном добавлении инди­каторного вируса, использованного при первоначальной постанов­ке РН, ко всем пробам сывороток, нейтрализовавшим вирус на первом этапе. В результате вновь возникает реакция взаимодейст­вия между вирусом и избыточным количеством антител. В пробах с более низким содержанием антител эта нейтрализация не про­исходит или будет частичной, в результате чего проявится ЦПД вируса на клетки. В пробах с избытком антител ЦПД будет вновь отсутствовать из-за полной нейтрализации вируса этими антите­лами.


Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 898 | Нарушение авторских прав







При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.005 сек.)