Реакция нейтрализации широко используется в вирусологической практике. Она предназначена для идентификации выделенного вируса, определения наличия антител и изменения их титра в сыворотке крови больных и переболевших животных, установления количественного содержания антител в лечебных, профилактических и диагностических препаратах (гамма-глобулины, диагностические сыворотки).
Сущность реакции нейтрализации заключается в способности вируснейтрализующих антител иммунных сывороток подавлять инфекционные свойства вируса. В результате этого вирус утрачивает способность размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения в чувствительной к нему биологической системе (культура клеток, развирающийся куриный эмбрион, организм восприимчивого лабораторного животного).
Достоинствами реакции нейтрализация являются ее универсальность и высокая специфичность. К недостаткам относятся: высокая трудоемкость, необходимость строгого соблюдения стерильности материалов и инструментов, высокая стоимость тест-объектов, необходимость проведения математических расчетов, относительная длительность при постановке реакции. На результаты РН, особенно на их достоверность и воспроизводимость, оказывают влияние ряд факторов: методика постановки реакции, способ и правильность ее учета, концентрация используемых сывороток и вирусов, метод разведения компонентов реакции и др. Вируснейтрализующие антитела накапливаются в организме в период выздоровления (реконвалесценции) и остаются в нем длительное время. Оптимальные сроки для обнаружения антител в каждом случае различны и зависят от особенностей иммунитета при той или иной инфекции. Например, при гриппе свиней максимальный титр вируснейтрализующих антител регистрируется между 14 и 27-м днями и снижается к 6 месяцам. При лейкозе птиц антитела выявляются спустя 4 недели после заражения и сохраняются в течение всей жизни.
Сыворотки, применяемые в РН, должны быть предварительно освобождены от термолабильных ингибиторов. Для этого их прогревают при разведении не менее чем в два раза в течение 30 мин при 56 °С. Однако, антитела к некоторым вирусам (парагриппа, респираторно-синцитиальной инфекции) чувствительны к прогреванию, поэтому при постановке РН с такими сыворотками его следует избегать.
При хранении сывороток титр антител постепенно снижается. Долго хранившиеся сыворотки активизируют добавлением к ним 1/10 объема комплемента, увеличивающего авидность антител. Вируснейтрализующие антитела хорошо сохраняются в лиофильно высушенном или замороженном состоянии (-20 °С).
Для разведения вирусов при постановке РН на лабораторных животных или в куриных эмбрионах используют фосфатно-буферный раствор (рН 7,0... 7,2). При работе с культурами клеток используют ту среду, которую применяют в качестве поддерживающей для данного вида клеток (среда 199, 2,5...5%-ный гемогидролизат и др.). Не следует применять раствор обычного изотонического хлорида натрия, поскольку в нем быстро инактивируются многие вирусы.
В зависимости от цели исследования применяют два варианта постановки РН: 1 — для идентификации и определения титра вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови (в данном случае соединяют равные объемы разных разведения сыворотки с постоянной дозой вируса); 2 — для идентификации и изучения неизвестного вируса (соединяют равные количества одного и того же разведения сыворотки с убывающими дозами вируса). Результаты реакции как в первом, так и во втором вариантах определяют о использованием лабораторных животных, РКЭ и культур клеток.
Компонентами реакции в 1-м варианте постановки РН являются: исследуемая сыворотка, стандартный вирусный антиген, тест-объект, для контрольной реакции — диагностическая и нормальная сыворотки крови. Реакцию ставят в два этапа: первый этап — определение титра вируса; второй — постановка основного опыта РН в этом варианте.
Для определения титра вируса готовят 10-кратные разведения вируссодержащего материала, обычно с 10-1 до 10-9, так как его титр редко превышает указанную величину. Берут 9 стерильных пробирок и в каждую из них вносят по 4,5 мл фосфатно-буферного раствора. Затем в первую добавляют 0,5 мл вируссодержащего материала (разведение 1:10 или 10-1), смесь перемешивают и 0,5 мл переносят во вторую пробирку (разведение 1:100 или 10-2). Из второй — 0,5 мл — в третья (10-3) и т.д., пользуясь при этом всякий раз чистой пипеткой. Каждым разведением вируссодержащего материала заражают лабораторных животных (4 гол.). Объем вводимого материала зависит от метода заражения, который связывают с тропизмом вируса. Например, при заражении нейротропным вирусом исследуемый материал вводят в мозг, пневмотропным — через нос, дерматропным — на скарифицированную кожу или внутрикожно и т.д. За животными наблюдают в течение 3...30 дней и более, в зависимости от возраста и вида животного и др. факторов. Наибольшее разведение вируса, обеспечивающее гибель половины (50%) зараженных животных, принимают за титр вируса, обозначаемого в данном случае символом ЛД50 (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Допустим, вирус в разведении 104 вызвал гибель 50% животных, это разведение и будет соответствовать 1 ЛД5о.Следовательно, 100 ЛД50 будет соответствовать разведению 102 (1:100). Это разведение чаще всего используют.
Аналогично определяют титр вируса на РКЭ по их гибели (ЭЛД 50 — эмбриональная летальная доза) или по патологоанатомическим изменениям (ЭИД 50 — эмбрионинфицирующая доза) в культуре клеток по цитопатическому действию (1 ТЦД50 — тканевая цитопатическая доза).
Постановка реакции. После установления титра вируса готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки, начиная с 1:2 до 1:128 и более, в зависимости от предполагаемого титра вируснейтрализующих антител, в объеме 0,5 мл и к каждому разведению сыворотки добавляют по 0,5 мл вируссодержащего материала в разведении, соответствующем 100 ЛД5о- Одновременно ставят контроли:
а) контроль вируса (100 ЛД50 вируссодержащего материала соединяют с физиологическим раствором в равных объемах);
б) контроль иммунной сыворотки (иммунную сыворотку в рабочем титре соединяют с вируссодержащим материалом в равных объемах);
в) контроль нормальной сыворотки (нормальную сыворотку соединяют с 100 ЛД5о вируса в равных объемах),
Пробирки встряхивают и выдерживают в термостате при 37 °С в течение 30...60 мин. Смесью из каждой пробирки, в том числе и из контрольных, заражают чувствительных лабораторных животных (4 гол.). Идентификацию вируснейтрализующих антител с применением данного тестобъекта проводят при диагностике ящура, бешенства, лейкоза птиц. Объем и место введения смеси те же, что были выбраны при определении 1 ЛД5о- Сроки наблюдения за животными аналогичны вышеуказанным.
Учет результатов. Вначале учитывают результаты контролей. В первом и третьем из них животные должны погибнуть, во втором— остаться в живых. Если исследуемая сыворотка содержит антитела, то они будут нейтрализовать патогенное действие вируса и животное не погибает. Однако, сыворотку используют в разведениях, и, в связи с этим, в определенной пробирке антител окажется недостаточно для нейтрализации вируса. Процент гибели животных будет нарастать в направлении большего разведения. Все это дает возможность определить титр вируснейтрализующих антител, который рассчитывается по методам Рида и Менча или Кербера. За титр антител исследуемой сыворотки принимают то разведение, которое предотвращает гибель 50% лабораторных животных от действия 100 ЛД5о вируса (табл.10). При использовании РКЭ результат РН учитывают по способности вируснейтрализующих антител сыворотки предотвращать гибель эмбрионов, появление фокусов поражения на хорионаллантоисе и снижать титр вирусных гемагглютининов у 50% куриных эмбрионов. Эти методы применимы при определении нейтрализующей активности сывороток по отношению к вирусам гриппа, оспы, болезни Ньюкасла, инфекционного ларинготрахеита и бронхита кур.
Результат РН в культуре клеток оценивают по способности вируснейтрализующих антител исследуемой сыворотки в определенных разведениях предотвращать развитие цитопатогенного эффекта (ЦПЭ), что используется при диагностике болезни Ayeски, ринопневмонии лошадей, вирусного гастроэнтерита свиней, болезни Тешена, лейкоза птиц и др. По торможению феномена гемадсорбции к зараженным вирусом клеткам эритроцитов курицы, человека, морской свинки диагностируют грипп и парагрипп.
Таблица 10
Схема постановки реакции нейтрализации (определение антител на белых мышах)
Компоненты
Номера лунок
Контроли
вируса
Имунная сыворотка
Нор-ная сыв-ка
Ф-Б раствор
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Исследуемая сыворотка
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5 в дез
раствор
0,5
0,5
Получаемые разведения
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
Вирус в 100 ЛД50
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5 в дез
раствор
0,5
0,5
0,5
Экспозиция 20 мин при комнатной температуре
Заражения мышей
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
Экспозиция 30...60 мин при комнатной температуре. Выжило/ погибло
Учет рез-ов
4/0
4/0
4/0
3/1
3/1
2/2
1/3
0/4
0/4
4/0
0/4
Титр антитела = 1:64
Компонентами реакции во 2-м варианте постановки служат: исследуемый вируссодержащий материал, диагностическая (известная), нормальная (отрицательная) и исследуемая сыворотки крови, тест-объект. Этот вариант позволяет идентифицировать исследуемый вирус и определить индекс нейтрализации (ИН) специфических и исследуемых сывороток.
Для постановка РН готовят постоянные разведения специфической и нормальной сывороток (обычно 1:10) и три ряда 10-кратно убывающих разведении вируса по 0,5 мл. Последнее разведение вируса, взятого в опыт, должно превышать его биологический титр, так как в противном случае будет невозможно рассчитать индекс нейтрализации: например, если титр вируса 107 ЕД5о> то в опыт следует брать вирус до разведения 10-8 В пробирки первого ряда добавляют специфическую сыворотку (1:10) по 0,5 мл, во второй ряд — нормальную сыворотку по 0,5 мл, в третий — физиологический раствор по 0,5 мл. Объем сыворотки и вируса должен быть одинаковым. Пробирки встряхивают и оставляют на контакт. Продолжительность этого периода и температуру варьируют в зависимости от вируса, с которым проводится работа. После инкубации смесь сыворотки с разведениями вируса в объеме по 0,2 мл вводят в чувствительную тест-систему, начиная с разведения 10-8. Затем проводят учет реакции (табл.11).
Таблица 11.
Схема реакции нейтрализации для идентификации вируса
Компоненты
Разведение вируса
Контроль сыворотток 1:10
Титр вируса, lg
Индекс нейтрализа-ции, lg
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
Специфическая сыворотка 1:10
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+_
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
Нормальная сыворотка 1:10
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
Физиологический раствор
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
-
-
Учет реакции. Если происходит нейтрализация вируса (нет изменений в чувствительном объекте), значит, антитела диагностической сыворотки специфичны исследуемому вирусу. Все это дает возможность определить вид вируса.
При учете результатов РН по этому варианту пользуются Е методом определения индекса нейтрализации по Риду и Менчу. Индекс нейтрализации представляет собой отношение дозы вируса в смеси с нормальной сывороткой, вызывающей изменения у 50% чувствительных объектов, к дозе вируса, вызывающей те же изменения в смеси с иммунной сывороткой. Или, другими словами, это число, показывающее, во сколько раз специфическая сыворотка снижает титр вируса по сравнению с нормальной. В нашем примере (табл.11):
ИН = Т 1/ Т 2 = 107 / 102 = 105
где Т1 — титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Tg — титр вируса в присутствии специфической сыворотки.
Индекс нейтрализации до 10 указывает на отсутствие вируснейтрализующих антител в сыворотке, от 11 до 49 считается сомнительным, а 50 и выше — положительным.
В настоящее время существуют различные модификации проведения РН. Приведем некоторые из них.
Микрометод РН. Применяется при диагностике везикулярного стоматита, гриппа, парагриппа, аденовирусных инфекций. При данном методе используют пластмассовые пластины, в лунках которых выращивают соответствующую культуру клеток (ПЭС, ФЭК, СПЭВ, ТБ). Затем в лунки вносят двукратные разведения испытуемой сыворотки, соединенные с суспензией вируса в концентрации100 ТКИД50 (тканевая инфицирующая доза) и через 4...7 суток инкубации оценивают выраженность цитопатического действия вирусов. Данный метод позволяет значительно снизить расходы исследуемых сывороток и вирусного диагностического материала, одновременно исследовать большое количество образцов сывороток.
Цветная проба. Суть этой реакции заключается в способности вируса подавлять обменные процессы в зараженных клетках культуры ткани. Клеточные суспензии с определенной концентрацией клеток добавляют в пробирку или в лунки пластмассовых пластин через час после внесения в них смеси вируса с определенными разведениями сыворотки. Цветная проба основана на том, что клетки, размножаясь в незараженных пробирках или пробирках со смесью вируса и нейтрализовавших его антител, образуют много кислых продуктов обмена, которые снижают рН питательной среды. Это легко обнаруживают благодаря включенному в состав среды индикаторному красителю (например, феноловому красному), цвет которого меняется в зависимости от рН среды. Красный цвет при рН 7,4.-7,8 становится оранжевым при рН 7,2, а при снижении рН ниже 7,0 — желтым. При гибели клеток под воздействием вируса не наблюдается выделения достаточного количества кислых продуктов, поэтому среда остается красной. Титр вируснейтрализующих антител определяют как последнее разведение сыворотки, которое в присутствии добавленного вируса позволило клеткам сохранить нормальные обменные процессы, а следовательно, и снизить рН среди до того же уровня, что и в незараженной контрольной культуре. Обычно цветную пробу широко используют при работе с энтеро- и аденовирусами животных, а также вирусами птиц (болезни Ньюкасла, инфекционного бурсита, инфекционного синовита сухожилий, болезни Марека, инфекционного бронхита птиц, герпеса индеек).
Метод супернейтрализации. Данный метод используется для более точного количественного выявления содержащихся в сыворотках антител. Он основан на повторном добавлении индикаторного вируса, использованного при первоначальной постановке РН, ко всем пробам сывороток, нейтрализовавшим вирус на первом этапе. В результате вновь возникает реакция взаимодействия между вирусом и избыточным количеством антител. В пробах с более низким содержанием антител эта нейтрализация не происходит или будет частичной, в результате чего проявится ЦПД вируса на клетки. В пробах с избытком антител ЦПД будет вновь отсутствовать из-за полной нейтрализации вируса этими антителами.