АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Реакция иммунодифузии (РИД, синоним: реакция диффузи­ей преципитации в агаровом геле) широко используется в лабора­торной диагностике инфекционного

Реакция иммунодифузии (РИД, синоним: реакция диффузи­ей преципитации в агаровом геле) широко используется в лабора­торной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рога­того скота, инфекционной анемии лошадей, болезни Ауески и др.

Сущность реакции заключается в том, что специфические антигены и антитела диффундируют в геле агара из мест локали­зации навстречу друг другу и, взаимодействуя, образуют полосы преципитации (комплекс: антиген + антитело), которые хорошо заметны на фоне прозрачного геля. Преципитат представляет со­бой барьер с селективными свойствами — в нем связываются только однотипные антигены и антитела, но он легко проницаем для других неродственных компонентов. Скорость диффузии ан­тигена и антител при одинаковой плотности агара обратно про­порциональна размерам их молекул, т.е. чем меньше молекула антигена, тем быстрее он диффундирует в геле и наоборот. Вслед­ствие различий в скорости диффузии отдельных антигенов, а также различного содержания их в исследуемом многокомпо­нентном растворе и специфических антител в иммунной сыворот­ке в агаре возникают многочисленные полосы преципитации, со­ответствующие отдельным системам антиген - антитело. РИД используют в двух вариантах: 1) для определения видовой принадлежности антигена; 2) для обнаружения специфиче­ских антител в исследуемой сыворотке крови. Кроме того, ее можно применять для спектрального анализа простых и ложных антигенных систем и установления количественного содержания антигена в разных субстратах, определения общего набора и ко­личественного содержания антител в соответствующих иммунных сыворотках, получаемых в разное время от различных видов жи­вотных и человека, контроля за чистотой получаемых антиген­ных препаратов и диагностических сывороток; изучения антиген­ного родства между вирусами.

Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором — оба. В зави­симости от того происходит ли диффузия по одной общей оси или во все стороны радиально, из резервуара в среду, иммунодиффузия называется линейной или радиальной.

В настоящее время используется ряд методов диффузионной преципитации: 1) метод простой диффузии в агаровый гель по Оудину; 2) метод двойной диффузии в агаровый гель (в пробирках) по Окли и Фулторпу; 3) метод двойной диффузии в агаровый гель (в капиллярах) по Вязову; 4) метод простой ради­альной иммунодиффузии по Манчини; 5) метод двойной диффу­зии в агаровый гель по Оухтерлони.

Компонентами 1-го варианта реакции являются: вируссодержащий материал (исследуемый антиген), преципитирующая сыворотка, 1%-ный агаровый гель; 2-го варианта: исследуемая сыворотка крови, вирусный диагностикум и 1%-ный агаровый гель. Для контрольной реакции необходимы: нормальная сыво­ротка крови животного — продуцента преципитирующей сыво­ротки, контрольный антиген — экстракт ткани здорового живот­ного того же вида, от которого получен вируссодержащий материал (ткань должна быть аналогична той, в которой локали­зуется вирус). Необходимым компонентом реакции иммунодиффузии яв­ляется гелевая среда, приготовленная из агара. К агаровому гелю предъявляют следующие требования. Он должен быть прозрач­ным, достаточно плотным (обычно используют 1-1,5 или 2%-ный раствор агара), стерильным, рН должен быть в пределах 6,4...8,5. Чаще всего используют агар фирмы "Дифко", агар Noble, Ferrak или очищенную агарозу. Приготовление геля из очи­щенных агаров ("Дифко" и др.) несложно. В этом случае берут 1 весовую часть агара и добавляют к ней 99 весовых частей физио­логического раствора (можно использовать забуференные или бу­ферные растворы с рН 7,3—7,4), Колбочку со смесью ставят в ки­пящую водяную баню, растворяют агар и добавляют консервант (мертиолят натрия 1:10000). Затем смесь разливают по пробиркам и употребляют по мере надобности. (Используемые для РИД сухие неочищенные агары различ­ных марок подвергают предварительной очистке. Берут одну часть его, заливают 30 частями дистиллированной воды, добав­ляют 0,5% хлористого кальция и кипятят до расплавления. Го­рячий агар-агар фильтруют через двойной слой марли и разлива­ют тонким слоем в стеклянные сосуды с плоским дном. После застывания агаровый гель разрезают на мелкие кусочки (1х1 см),складывают в стеклянную банку, обвязывают сверху марлей и ставят под струю водопроводной воды на трое суток для промыва­ния. Затем воду сливают через марлю. Промытый гель расплав­ляют в водяной бане, добавляют к нему равное количество 1,6%-ного раствора NaCI и мертиолят натрия 1:10000. Приготов­ленный таким образом агаровый гель разливают по колбочкам и до употребления хранят при температуре 4 °С. Рекомендуется хранить агар в больших объемах (по30—60 мл), так как при по­вторном разогревании жидкость испаряется, изменяется концен­трация агара, нарушаются его физико-химические свойства.)

РИД по Оухтерлони проводят в двух модификациях: мак­ропреципитация в агаровом геле в чашках Петри и микропреци­питация в агаровом геле на предметных стеклах. В последнее время макропреципитацию в чашках Петри применяют реже из-за необходимости большого количества компонентов. Микро­преципитация протекает быстрее (расходуется меньше реагентов), технически она не сложнее макрометода и по чувствительности не уступает ему.

Макропреципитация в агаре в чашках Петри сводится к сле­дующему. Расплавленный агаровый гель в количестве 25 мл налива­ют в чашки Петри. В остывшей агаровой пластине выштамповывают пробойником или стеклянной трубочкой отверстия (диаметр 4-7 мм и более, в зависимости от цели опыта). В последнем случае для того, чтобы лунки были расположены на равных расстояниях, под чашку необходимо подкладывать трафарет. Лунки должны отстоять друг от друга по меньшей мере на 3 мм, расстояние более 10 мм употребля­ется редко.

Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединенной с вакуумной установкой. Необходимо при этом избе­гать отслоения от стекла и повреждения агара.

При исследовании антигенов в центральную лунку левого шестиугольника (1-й вариант расположения лунок) пастеровской пипеткой наливают 2-3 капли преципитирующей сыворотки или специфического т -глобулина, в четыре периферийные — иссле­дуемые антигены, в пятую — специфический антиген (контроль №1), в шестую — антиген из нормальной ткани (контроль №2). В центральную лунку правого шестиугольника наливают 2-3 капли нормальной сыворотки, а в остальные — исследуемые антигены, антиген из нормальной ткани, стандартный вирусный антиген (соответственно контроли №3-8). Компоненты РИД вносят с таким расчетом, чтобы у верхнего края образовался несколько вогнутый мениск и жидкость не растекалась по поверхности агара.

После заполнения лунок чашки Петри закрывают крышка­ми и помещают во влажную камеру при температурах, 4 °С, 18...25°, 37...38 °С на 24—72 ч (в зависимости от вида вируса). Ре­акцию оценивают визуально в косопроходящем или отраженно-рассеяном свете, начиная с контрольной. В нашем примере поло­сы преципитации наблюдают в контроле 1, в контролях №2-8 их не должно быть. Если исследуемые антигены (левый шестиуголь­ник) специфичны антителам преципитирующей сыворотки, то между центральной лункой и первыми четырьмя лунками пери­ферии образуются полосы преципитации (рис.).

При определении антител постановка реакции методически осуществляется аналогично, лишь с той разницей, что в цен­тральную лунку левого шестиугольника наливают стандартный антиген, а в четыре периферические — исследуемые сыворотки, в пятую — стандартную преципитирующую сыворотку (контроль № 1), в шестую — нормальную сыворотку (контроль № 2). В цен­тральную лунку правого шестиугольника вносят контрольный антиген, а в периферические — исследуемые сыворотки, положи­тельную и нормальную сыворотки (контроль № 3-8). Вначале учи­тывают результат контрольной реакции. В нашем примере полосу преципитации наблюдают в контроле№ 1, в контролях же № 2-8 их не отмечают. Если в исследуемых сыворотках содержатся преци-литины, соответствующие антигену, между центральной лункой и первыми четырьмя лунками, расположенными по периферии, на­блюдают полосы преципитации.

Для микропреципитации в агаре на предметных стеклах необходимы чистые, тщательно обезжиренные предметные стек­ла. Их помещают на горизонтальную поверхность (стол). Слегка подогретой пипеткой (40...45°) набирают нужное количество (3—4 мл) расплавленного (50...60°) 1%-ного агарового геля и вы­ливают на поверхность стекла. Толщина слоя агара при этом должна быть1...1.5 мм. После застывания агара на поверхности каждого стекла стандартными штампами выдавливают лунки, из которых затем отсасывают агар. Размеры и форма штампа могут быть различными, в зависимости от цели опыта. Затем в лунки пастеровскими пипетками с тонко оттянутыми концами или микропипетками наливают антигены и антисыворотки (аналогично макрометоду). После за­полнения луночек реагентами стекла помещают во влажную ка­меру (чашка Петри с фильтровальной бумагой, смоченной водой; эксикатор с герметически закрывающейся крышкой и др.) и ос­тавляют при комнатной температуре или ставят в термостат (37 °С).

Предварительный учет результатов РИД производят через 8...10 ч, основной — через 24 ч и окончательный — через 48...72 ч.

При оптимальном соотношении антигенов(АГ) и антител (AT) после окончания диффузии линия преципитации располага­ется примерно на середине расстояния между лунками, перпен­дикулярно к оси, соединяющих центра. Если один из компонен­тов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим со­держанием реагента. При достаточно высокой концентрации ком­понентов реакции она может достигать соседнего сектора агаровой пластинки, в котором формируются полосы преципитации другой антигенной системы. Характер расположения полос определяет степень родства антигенов. Принципиально возможны четыре ва­рианта расположения линий преципитации.

1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это гово­рит об идентичности обоих антигенов.

2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реа­гирующие сAT детерминанты АГ неидентичны и, следовательно, сами антигены различны.

3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой "шпоры". "Шпора" часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с АГ сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обла­дают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответ­ствующимиAT иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из АГ имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих AT в антисыворотке приводит к образованию "шпоры".

4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это значит, что оба антигена содержат как одина­ковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реак­цию с антителами полиспецифической сыворотки.

Рис. Расположение линий преципитации при сравнительных исследованиях методам двойной радиальной иммунодиффузии:

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 2126 | Нарушение авторских прав