АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Реакция связывания комплемента (РСК) — один из наиболее ценных методов, имеющихся в распоряжении вирусолога

Реакция связывания комплемента (РСК) — один из наиболее ценных методов, имеющихся в распоряжении вирусолога. По чувствительности эта реакция уступает реакциям нейтрализации, торможения гемагглютинации или методу флуоресцирующих антител, однако она обладает и рядом преиму­ществ. Во-первых, она намного проще. Во-вторых, при помощи реакции свя­зывания комплемента можно выявить некоторые вирусные антигены, не обла­дающие инфекционностью или гемагглютинирующей активностью, например так называемые «растворимые» антигены миксовирусов, капсиды энтеровирусов, а также «неоантигены», образуемые некоторыми онкогенными виру­сами.

Обнаружение комплементсвязывающих антител — один из наиболее ценных методов диагностики вирусных инфекций. Дело в том, что комплементсвязывающие антигены многих вирусов обладают групповой специфич­ностью. Так, например, растворимые антигены различных штаммов вирусов гриппа А и В обладают групповой, а не штаммовой специфичностью. Аденовирусы также содержат групповой комплементсвязывающий антиген. Комплементсвязывающие антигены групповой специфичности образуют и неко­торые арбовирусы.

Очевидно, что групповая специфичность вирусных антигенов исключает возможность использования этого теста для более детальной диагностики — установления типовой принадлежности вируса. Тем не менее РСК является очень ценным методом массовой диагностики, так как в подобных случаях в первую очередь требуется установить групповую принадлежность вируса. При желании тип вируса можно затем установить с помощью более специ­фичных серологических методов.

При естественных заболеваниях, вызываемых некоторыми другими виру­сами, например коксаки или ECHO, также образуются гетерологичные анти­тела, однако это явление наблюдается не столь регулярно, чтобы на его осно­ве можно было идентифицировать групповую принадлежность вируса. Поэто­му в случае заболеваний, вызываемых этими агентами, диагностическая ценность РСК невелика.

Особую ценность представляет РСК для изучения антигенных взаимо­связей между вирусами.

Реакция связывания комплемента (РСК) широко использу­ется в диагностической практике для обнаружения специфиче­ских комплементсвязывающих антител в исследуемых сыворотках крови и для определения вида или типа вируса. Ее применяют для диагностики многих вирусных инфекций (ящура, энцефаломиелита лошадей и др.).

Сущность реакции состоит в том, что здесь участвуют две системы: специфическая (исследуемая сыворотка + антиген) и индикаторная (гемолитическая сыворотка или гемолизин + взвесь эритроцитов барана). Связующим компонентом между ними яв­ляется комплемент. В зависимости от того, где он адсорбируется, наблюдают тот или иной исход реакции. Если комплемент ис­пользуется в специфической системе — реакция положительная, индикаторной — отрицательная. Положительная реакция характеризуется задержкойгемолиза (эритроциты находятся вовзвеси — жидкость мутная,красного цвета), отрицательная — полнымгемолизом (лизис эритроцитов— жидкость прозрачная, красного цвета.

Компоненты реакции следующие: исследуемая сыворотка крови (исследуемый антиген), стандартный вирусный антиген (стандартная сыворотка), гемолитическая сыворотка или гемоли­зин, эритроциты барана, комплемент. В качестве разбавителя ис­пользуют изотонический раствор хлорида натрия (рН 7,2... 7,4) или различные буферные растворы.

Рис. Реакция связывания комплемента: а — положительная (задержка гемолиза); б — отрицательная (гемолиз)

ПостановкаРСК при вирусных инфекциях значительно отличается от постановкиеепри бактериальных инфекциях. Это обусловлен о рядомспецифических свойств вирусов.

1. Дляосвобождения вирусного антигенаприходится обра­батыватьинфекционный материалсцелью извлеченияего из клетки.

2. Вирусные антигены не отличаютсявысокой устойчиво­стью, поэтомуматериал дляих полученияберут от павших жи­вотных впервые часы гибели, а лучшепри жизни.Консервиро­вание вируссодержащего материала часто не даетположительных результатов, так как многиеиз них вызывают разрушениевирус­ного антигена.

3. Неравномерность фиксации комплемента при различном соотношении концентраций антиген-антитело.Комплекс анти­ген + антитело образуется только при строгих количественных соотношениях этих компонентов.При избыткеантител фиксациякомплемента резко снижается. То же наблюдают ипри избытке антигена, гдеподавлениефиксации происходитеще быстрее. По­этому дляустановления оптимальной дозы комплементанеобхо­димо предварительноетитрование антигена и антитела.

4. Незначительный объем комплекса антиген-антитело. Размер вирусных частиц, вступающих в этот комплекс, а следо­вательно, и площадь фиксации комплемента небольшие. С увели­чением объема комплекса антиген-антитело путем удлинения пе­риода фиксации компонента повышается чувствительность реакции, но снижается ее специфичность, так как увеличивается фиксация комплемента неспецифическими тканевыми антигена­ми.

5. Высокая комплементарная активностьвирусных антиге­нов. В своемсоставе онисодержат тканевые антигены, что меша­етпроведению реакции (неспецифическая фиксация комплемента). Для исключения этого явления необходимаболее полная очистка вирусных антигенов от тканевых фрагментов.

Кроме того, существенной помехой для РСК при диагности­ке вирусных заболеваний животных и человека является нерав­номерное накопление антигена и антител в различные периоды болезни и особенно при разных инфекциях. Поэтому постановка РСК должна иметь особенности не только в зависимости от характера заболевания, нои от ее цели(обнаружение антигена, антител,титрование вируса и т.д.).

Дляповышения чувствительностиРСК требуется некоторое изменение методикиее постановки — связывание комплемента в РСК при вирусныхинфекциях проводят длительно ( 18...20 ч)и на холоде (О...4 °С). В этих условиях антиген и антитело успевают прореагировать наиболее полно, что повышает чувствительность реакции. Однако, несмотря натрудности постановки РСК, эта реакция нашла применение для обнаружения вируса в исследуе­мом материале.Типичным примеромможет служить постановка РСК дляобнаружения вируса ящура, определения его типа и ва­рианта,

Антигены и предъявляемые к нимтребования: 1) достаточновысокая антигенная активность; 2) отсутствие примесей антигенов организма хозяина; 3) отсутствие компонентов, обладающих антикомплемен­тарной активностью; 4) безопасность в отношении распространения инфекции и безвредности для работающего персонала; 5) хорошая сохраняемость при разных температурных ре­жимах; 6) стандартность антигена.

Приготовление антигенов. Инфекционный материал осво­бождают от грубых тканевых частиц,измельчают ножницами и растирают в ступкес кварцевым песком,разбавляют буферным раствором и центрифугируют.Надосадочную жидкость отсасыва­ют и подвергают дальнейшейобработке. Эта обработка преследует следующие цели: максимальноеосвобождение вируса из клеток, удаление клеточных материалови разрушение прокомплементарнойактивности.Вирусные материалы для антигеновберут из органов и тка­нейестественно илиэкспериментально зараженныхживотныхсучетомтропизма вирусов и сроков вирусовыделения. Антигены можно получатьиз зараженных куриныхэмбрионов и культуры клетокс учетом стадии репродукции вируса иособенностей его накопления в клетках иливнеклеточнов питательной среде. Од­нако, влюбом случаев препаратах антигеновотносительно много материала клетокхозяина. Такой материалпотенциально спосо­бен взаимодействовать с антителами. Поэтому всегда необходимо ставитьконтрольную реакцию с антигеном,полученным из ана­логичнойнезараженной ткани. Такимобразом определяют нали­чие впрепарате антигенов клетокхозяина. Их количество можно уменьшить,очистив препарат с помощью центрифугирования в градиенте плотности,хроматографией наколонке или путем воз­действия фторуглеродныхсоединений или органических растворителей (ацетон, эфир, хлороформ). Некоторые антигены обладают антикомплементарной ак­тивностью, т.е. способны сами по себе связывать или разрушать те или иные компоненты комплемента. Удалять материал, обладающий антикомплементарной активностью, рекомендуется с по­мощью фторуглеродистых соединений или обрабатывая его про­гретым комплементом морской свинки.

Приготовление сывороток. Для получения сывороток, содержащих комплементсвязывающие антитела, лабораторных животных под­вергают либо иммунизации по определенным схемам, либо зара­жению инфекционным агентом. Введению активного вируса предшествуют две-три инъекции формалинизированной суспен­зии. После получения сыворотки титруют (определяют количест­во антител), а затем лиофилизируют или консервируют. Лиофильно высушенные сыворотки можно хранить в условиях холодильника до 4-х лет. Для консервирования сывороток наиболее удобным и обще­доступным средством является фенол. Готовят 5%-ный раствор фенола на физрастворе и добавляют в сыворотки из расчета 1:9. Добавление проводят по каплям при постоянном перемешивании. Фенолизированные сыворотки фасуют по ампулам и хранят в ус­ловиях холодильника в течение года. Все сыворотки, используемые в РСК, перед опытом обяза­тельно инактивируют в течение30 мин: сыворотки морской свинки и кролика при56 °С, крыс — при 60 °С, собак — 65 °С, мышей — 60 °С, крупного рогатого скота — 56...58 °С, лошадей и овец—58-60 °С.

Сыворотки, как и антигены, тоже обладают антикомплементарностью, т.е. способностью связывать комплемент в отсут­ствие антигена и тем самым задерживать гемолиз. Она может быть обусловлена как длительным хранением сывороток, так и свойством, присущим некоторым животных (например, кроликам). Поэтому сыворотки нужно хранить в состоянии глу­бокой заморозки или лиофильно высушенными. Кроме того, сле­дует тщательно отделять сыворотку от сгустка, не захватывая эритроцитов. Для устранения антикомплементарности их прогре­вают при температуре на 1—2 °С выше необходимой для инактивации комплемента, или замораживют при минус (20...70) °С с после­дующим удалением осадка центрифугированием. Хорошие результаты дает обработка сывороток углекисло­той (см. РЗГА) или комплементом морской свинки. Для этого к 3-м объемам сыворотки добавляют 1 объем комплемента морской свинки, смесь инкубируют в течение ночи при 4 °С, а затем 30 мин при 37 °С. После этого сыворотку разбавляют 1:4 или 1:8 буферным раствором и инактивируют при 60 °С в течение 30 мин.

Эритроциты. Обычно при постановке реакции применяют эритроциты барана. Их получение описано в занятии 12. Для длительного хранения в последнее время широко используют рас­твор Альсевера. При смешивании 2 частей крови и 1 части этого раствора эритроциты сохраняются при 4 °С в течение 4—6 недель.

Раствор Альсевера готовят по следующей прописи: декстрозы — 20,5 г, цитрата натрия — 8,0 г, лимонной кислоты — 0,55 г, хлористого натрия — 4,2 г, дистиллированной воды — до 100 мл; рН раствора 6,1. Раствор автоклавируют при0,06 МГГа в течение 10 мин или пропускаютчерез фильтр Миллипор и другиес раз­мером пор 0,22 мкм.

Комплемент выпускаютбиофабрики в лиофилизированномвиде.Но его можнополучить в любой лаборатории. Для этого у морских свинокиз сердца берут кровь, помещаютее в термостат на30 мин,сгусток отделяютстерильнойспицей и выдерживаютночь в холодильнике.Затем сыворотку собирают пастеровскойпипеткой и консервируют,добавляя к 10 млее 0,2 г борной ки­слотыи 0,3 г сернокислого натрия. Комплементсохраняется до 2-х недель в холодильникев замороженном состоянии.Его титруют каждыйраз в день постановки главного опыта.

Гемолизин — сыворотка крови кролика, иммунизированно­го эритроцитами барана, Гемолизин выпускают биофабрики в су­хом виде.

Обнаружение и идентификация вируса ящура в РСК. РСК по 100%-ному гемолизу применяют для определения типов и ва­риантов вируса ящура. РСК ставят в различных объемах: если общий объем 1 мл — каждый компонент берут в объеме 0,2 мл; общийобъем0, 5 мл — каждыйкомпонент берут в объеме 0,1 мл.

Дляприготовление антигена стенки афтот больных живот­ных отмывают отконсервирующей жидкости физраствором, вы­сушивают фильтровальной бумагой, взвешивают, измельчают и тщательнорастираютв ступке с песком, добавляют двойное по отношению к массе афт количествофизраствора. Полученную суспензию экстрагируютпри комнатной температуре в течение 2 ч,замораживают до минус (10...20) "С в течение5...18 ч.После раз­мораживания центрифугируют.Надосадочную жидкость инактивируют40 мин при58 °С и используют в качестве антигена РСК.

Методика постановки РСК следующая

1. Титрование гемолизина. Гемолизин титруют при полу­ченииего новой серии. Выпускае

мый биофабриками гемолизин часто консервирован глицерином(1:1). Вначале готовят основное разведение1:100. Дляэтого берут0,2 мл гемолизина и9,8 мл физраствора. Из него готовят разведение 1:1000-к 1 мл гемо­лизина 1:100 добавляют 9 мл физ раствора. Из ос­новного раствора (1:1000) готовят все последующие по указанной ниже схеме (табл.12).Получив необходимые разведения гемолизина, проводят его титрование (табл. 13).

Табл.12

Схема приготовления разведении гемолизина

Таблица13

Схема титрования гемолизина

Обозначения: ПГ — полный гемолиз; ЧЗГ — частичная задержка гемолиза; ЗГ — задержка гемолиза.

При этом необходимы следующие контроли: 1) контроль эритроцитов для исключения спонтанного гемолиза (0,5 мл 2%-ной суспензии эритроцитов + 2 мл физиологического раствора); 2) контроль гемолизина для исключения гемолиза эритроцитов без комплемента (0,5 мл разведения 1:1000 гемоли­зина + 0,5 мл 2%-ной взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологиче­ского раствора); 3) контроль комплемента для исключения гемо­лиза эритроцитов без участия гемолизина (0,5 мл 1:20 комплемента + 0,5 мл 2%-ной взвеси эритроцитов + 1,5 мл фи­зиологического раствора); 4) контроль гемолитической системы (0,5 мл разведения 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 2%-ной взвеси эритроцитов + 0,5 мл разведения 1:20 комплемента — 1мл физио­логического раствора).

При титровании устанавливают предельный титр гемолизи­на, т.е. его минимальное количество, способное вызвать лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В нашем примере (табл.13) — это количество гемолизина в разведении 1:3000. В первых трех контролях должна быть полная задержка гемолиза, в четвертом контроле — полный гемолиз.

В главный опыт берут 4-х-кратную концентрацию гемоли­зина от его предельного титра. Значит, рабочее разведение будет 1:750. А если он консервирован глицерином (1:1), то для приго­товления рабочего разведения берут 2:750 или 0,2 мл цельного гемолизина и 74,8 мл физиологического раствора.

2. Приготовление гемолитической системы. Смешивают гемолизин в рабочем титре с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов барана. Перед использованием гемолитическую сис­тему выдерживают в термостате 30 мин при 37 °С для сенси­билизации эритроцитов.

3. Приготовление 2%-ной суспензии эритроцитов. К 2 мл осадка отмытых эритроцитов барана добавляют 98 мл физиологи­ческого раствора.

4. Титрование комплемента. Комплемент титруют в гемо­литической системе в день главного опыта по схеме, приведенной в (табл.14).

Таблица 14

Схема титрования комплемента

Обозначения: см. в табл.13.

Титром комплемента считают то его наименьшее количест­во, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. При опреде­лении типа вируса ящура используют комплемент с титром, не ниже 2,5 %.

Для постановки главного опыта РСК комплемент берут с избытком в 1% или в две условные единицы от его титра в гемсистеме. Например, титр комплемента в гемсистеме 2 %, в глав­ный опыт берут 3 %. Для приготовления рабочей дозы к 3 мл нативного цельного комплемента добавляют 97 мл физиологиче­ского раствора.

Приготовление разведении комплемента, определение его активности и вычисление рабочей дозы требуют в подготовке РСК наибольшего внимания. Правильно выбранная рабочая доза ком­племента — непременное условие нормального течения реакции, что обеспечивает достоверность результатов.

При определении типа вируса ящура типоспецифические сыворотки и стандартные антигены, выпускаемые биофабриками, используют в удвоенном предельном титре. Например, если титр сыворотки, указанный на этикетке, равен 1:40, рабочий титр ра­вен 1:20.

5. Постановка главного опыта. Одновременно с главным опытом ставят контроль всех специфических ящурных антигенов и сывороток согласно схеме (табл.15). Компоненты разливают в следующем порядке:

1) специфические сыворотки в рабочем титре по 0,2 мл для каждой сыворотки — один ряд по вертикали;

2) специфические антигены в рабочем титре по 0,2 мл — в первые семь рядов по горизонтали, для каждого антигена один ряд;

3) испытуемый антиген в разведениях по 0,2 мл — для ка­ждого разведения один ряд пробирок по горизонтали;

4) физиологический раствор по 0,2 мл — в последний ряд по горизонтали (контроль сывороток) вместо антигена и в послед­ний ряд по вертикали (контроль антигенов) вместо сывороток;

5) комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении — во все пробирки главного опыта.

Пробирки осторожно встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин при 37...38°С.

6) во все пробирки наливают по 0,4 мл гемолитической сис­темы. Пробирки снова встряхивают и ставят в водяную баню на 30 мин при 37...38 °С.

Учет реакции проводят через 5—10 мин после водяной бани и окончательный результат получают через 10—12 ч. Степень за­держки гемолиза оценивают в плюсах:

++++ —100%-ная задержка; +++ — 75%-ная задержка;

++— 50%-ная задержка; +— 25%-ная задержка; — полный гемолиз.

Если испытуемый антиген гомологичен специфическим ан­тителам, то будет задержка гемолиза и реакция считается поло­жительной: если же гомологичные антитела отсутствуют — реак­ция отрицательная и наблюдается полный гемолиз.

При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его вари­ант. Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антиге­ны — в удвоенном.

Микрометод РСК. В последнее время для количественного учета РСК применяют технику постановки реакции в малых объ­емах, Для этого используют наборы панелей с V-образной конфи­гурацией лунок и калиброванных капельных пипеток системы Такачи. Реакцию ставят в объеме 0,125 мл, т.е. в 8 раз меньшем, чем при описанном выше методе. Каждый компонент берут в объеме 0,025 мл.

Таблица 15

Схема главного опыта РСК по определению типа вируса ящура

Примечание: все стандартные антигены и сыворотки активны и специфичны. Испытуемый антиген относится к типу А.

Техника подготовки реагентов, приготовление стандартов и постановка реакции такие же, как и при макрометоде. Неболь­шой расход реагентов и быстрота разлива компонентов капель­ными микропипетками делают микрометод очень удобным при постановке перекрестных реакций, когда определяют антигенное родство нескольких штаммов.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 966 | Нарушение авторских прав