АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Реакция непрямой гемагглютинации позволяет ре­шить следующие диагностические задачи:1) обнаружить антитела и определить их титр в исследуе­мых сыворотках

Реакция непрямой гемагглютинации позволяет ре­шить следующие диагностические задачи:1) обнаружить антитела и определить их титр в исследуе­мых сыворотках крови;

2) обнаружить и идентифицировать неизвестный вирусный антиген.

Сущность реакции в том, что эритроциты, на кото­рых предварительно адсорбированы антигены или антитела, спо­собны агглютинироваться в присутствии гомологичных антител или антигенов. Эритроциты выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых про­исходит в результате реакции антиген-антитело. Регистрируют данную реакцию по характеру образовавшегося осадка эритроци­тов, т.о., она является сугубо специфической серологической. Необходимо отметить, что РНГА отличается от РГА. В РГА эритроциты агглютинируются с рецепторами вирусов за счет сво­их комплементарных рецепторов. В РНГА агглютинация проис­ходит за счет образования комплексов антиген + антитело (рис.). Если к поверхности эритроцитов присоединить анти­гены, получают антигенный эритроцитарный диагностикум, способный в исследуемой сыво­ротке определять антитела. И, наобо­рот, эритроциты, сенсибилизирован­ные антителами, на­зывают антительным эритроцитарным диагностику-

мом и применяют для быстрого об­наружения антигенов в различных субстратах.

Достоинства РНГА. Эта реакция обладает высокой чувствительностью, превосходя РИД, РСК и приближа­ясь к иммуноферментному анализу, отличается простотой техни­ки постановки и быстротой ответа (2...3 ч). Недостаток — опреде­ленные трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов.

Компоненты реакции. Для определения антител в иссле­дуемых сыворотках необходимо иметь: а) антигенный эритроцитарный диагностикум; б) исследуемую сыворотку крови; в) разбавитель (в нем ставится реакция). Для определения антигенов в исследуемых биологических жидкостях необходимо иметь: а) антительный эритроцитатный диагностикум; б) исследуемый биологический субстрат; в) разбавитель.

Постановка РНГА включает следующие основные этапы:

а) приготовление растворов и подготовка исследуемых жидкостей;

б) получение эритроцитарных диагностикумов;

в) постановка главного опыта РНГА.

Обычно в лабораториях ставят только главный опыт, а остальные процедуры проводят на предприятиях биологической промышленности.

Подготовка растворов и исследуемых жидкостей. Физио­логический раствор, забуференный физраствор (рН 7,2), разбави­тель готовят на дистиллированной воде. Физраствор готовят по общепринятой методике. Для приготовления забуференного физ-раствора с рН 7,2 к 1 л последнего добавляют 0,49 г КНаР04 и 1,62 г Na2HP04, стерилизуют

кипячением, охлаждают и исполь­зуют в работе. Этот раствор применяют для отмывания эритроци­тов, акролеинизации и танизации их. Разбавитель готовят, добавляя к физраствору 0,3% фенола и 1% нормальной лошадиной сыворотки. Его используют для раз­ведения исследуемых сывороток или других жидкостей, а также для хранения эритроцитарного диагностикума. Нормальную ло­шадиную сыворотку, исследуемые сыворотки и другие жидкости абсорбируют эритроцитами с целью освобождения от неспецифи­ческих гемагглютининов. С этой целью к одному объему прове­ряемой биологической жидкости прибавляют 0,1 объема осадка отмытых эритроцитов, пробирку со смесью встряхивают и выдер­живают при 37 °С в течение 30 мин, затем центрифугируют, из­влекают надосадочную жидкость и используют в работе.

Приготовление сенсибилизированных эритроцитов вклю­чает:

а) получение эритроцитов. Для этого используют кровь бара­на, крыс, человека. Кровь, полученную из яремной вены, дефибринируют с бусами в течение 20...30 мин и трехкрат­но отмывают забуференным физраствором. Затем их стабилизируют, подвергают танизации и сенсибилизации. В настоящее время чаще применяют эритроциты птиц — кур, индеек, уток. Приготов­ленные из них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет со­кратить сроки исследования без потери чувствительности;

б) стабилизация эритроцитов. Преимущество стабилизиро­ванных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для стабилизации эритроцитов предложено много методов. Чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Приводим один из методов. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 10%-ную взвесь на забуференном физрастворе рН 7,2. Одновременно готовят 0,2%-ный раствор акролеина на этом же растворителе. Соединяют их в равных объемах и ставят в водяную баню при 37 °С на 30 мин. После стабилизации эритроциты трижды отмывают забуференным физраствором и ресуспендируют в этом же растворе до 10%-ной концентрации, разливают по пробиркам и хранят при 2...4 °С. Срок хранения — 1 год;

в) танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты изучен слабо. Но при этом достигается главное — танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбционной емкостью. Фармакопейный танин должен обладать хорошей раствори­мостью в воде. Хранят его в прохладном сухом месте в сосуде, обернутом в черную бумагу. Раствор танина готовят непосредст­венно перед опытом. Для этого берут навеску 0,25 г порошкооб­разного танина и растворяют в 50 мл забуференного физраствора рН 7,2. Получают разведение 1:200, которое является основным и сохраняется на холоде при 2...4 °С в течение месяца. Из основного разведения готовят рабочее (1:20000). К 5%-ной взвеси акролеинизированных эритроцитов на за­буференном физрастворе добавляют равный объем раствора тани­на в разведении 1:20000. Смесь выдерживают в водяной бане 20...30 мин при 37 °С. В дальнейшем производят отмывание физ­раствором 2-3 раза и осадок ресуспендируют в физрастворе до 50%-ной концентрации. Хранят танизированные эритроциты при температуре 2...4 °С. Контроль на их самоагглютинацию ставят через 18...20 ч после приготовления. Для этого в лунке панели смешивают кап­лю полученной 2%-ной суспензии танизированных эритроцитов и каплю разбавителя. Через два часа эритроциты должны осесть на дно лунки в виде компактной точки. В случае незначительной агглютинации танизированных эритроцитов (+ или ++) суспензию необходимо дополнительно выдержать при 2...4 °С в течение 2...3 суток, после чего повторяют контроль. Если эритроциты и в этом случае оседают в виде "зонтика", то их считают непригод­ными и готовят заново.

г) Сенсибилизация эритроцитов. Для этого используют ан­тисыворотки или антигены. К 0,2 мл 50%-ной суспензии акро­леинизированных танизированных эритроцитов на физрастворе добавляют 0,2 мл раствора антигена или антител (концентрация по белку 2 мг/мл) и 0,6 мл физраствора. К данной смеси приливают по каплям 1 мл 0,1%-ного рас­твора хрома хлорида и оставляют при комнатной температуре не более, чем на 5 мин. Реакцию останавливают прибавлением 20...50 объемов 0,02 М фосфатно-буферного раствора рН 7,2, для приготовления которого берут 50 мл фосфатного буфера и 325 мл дистиллированной воды. Затем трижды отмывают этим же буфером и хранят в рабочей концентрации (2%-ная взвесь в разбавителе). Для конъюгации можно использовать и другие конъюгирующие агенты (глютаровый альдегид, риванол, ализариновый синий).

Полученные таким образом сенсибилизированные эритроци­ты используют в РНГА.

Основной опыт РНГА. Реакцию ставят в лунках пластмас­совых панелей. В последнее время применяют микрометод с по­мощью прибора Такачи. Исследуемые и контрольные сы­воротки прогревают 30 мин при 56 °С. Исследуемые сыворотки крови разводят разбавителем от 1:2 до 1:256. К каждому разведению добавляют каплю эритроцитарного диагностикума. Смесь компонентов встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2...3 ч, но не раньше полного осаждения эритроцитов в контроле (табл.9).

Одновременно ставят контроли: 1) заведомо положительная сыворотка ++++ эритроцитарный диагностикум; 2) заведомо отрицательная сыворотка + эритроцитарный ди­агностикум; 3) разбавитель + эритроцитарный диагностикум;

4) учет реакции. Реакцию учитывают по 4-х бальной систе­ме и выражают в плюсах в зависимости от интенсивности агглю­тинации:

Таблица 9

Основной опыт РНГА (для определения антител)

Титр антител — 1:64

++++ — хорошо выраженный "зонтик" с загибающимися краями;

+++ — "зонтик" с ровными краями;

++ — "зонтик" со слабо выраженным кольцом по краю;

+ — отчетливо выраженное кольцо на фоне слабо выражен­ного "зонтика";

- — на дне лунки компактная точка эритроцитов. За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее раз­ведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не ниже, чем на ++. В нашем примере (табл.9) титр антител оставляет 1:64.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1104 | Нарушение авторских прав