АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Краткие теоретические сведения. Реакция коагглютинации (РКОА) нахо­дит широкое применение для идентификации вирусов гриппа, герпеса

Реакция коагглютинации (РКОА) нахо­дит широкое применение для идентификации вирусов гриппа, герпеса, онкогенных вирусов, ротавирусов и др. Достоинства РКОА: а) высокая экономич­ность (в50-250 раз дешевле других методов); б) высокая чувствительн -

ость, не уступающая в ряде случаев ИФА; в) простота постановки (отсутствие необходимости в дорогом оборудовании для приготовления реа­гентов и учета реакции).

Рис.68. Принцип реакции коагглютинации: 1 — золотистые стафилококки (штамм Cowan-1); 2 — белок А; 3 — Fc-фрагмент антител; 4 — Fob-фрагменты антител; 5 — антиген; 6 — феномен коагглютинации

Сущность РКОА состоит в том, что белок А (видоспецифический протеин) золотистого стафилококка обладает способ­ностью соединяться с Fc- фрагментом IgG человека и ряда млекопитающих, в т.ч. лабора­торных животных — продуцен­тов антител (кроликов, морских свинок, крыс, мышей, коз и т.д.). Белок А способен реагиро­вать не только со свободными молекулами иммуноглобулинов, находящимися в растворе, но и с иммуноглобулинами, фиксиро­ванными на клеточных поверх­ностях, находящихся в составе иммунного комплекса. При этом Fab- фрагменты остаются свободными для реакции с гомологичными антигенами (рис.68).

В постановке данной реакции модно выделить три основных этапа: 1) получение активной и стабильной по содержанию белка А взвеси золотистого стафилококка; 2) определение требований к иммунной сыворотке, используемой для сенсибилизации стафи­лококка, а также правильное проведение процесса сенсибилиза­ции; 3) постановка реакции и учет ее результатов.

Получение взвеси золотистого стафилококка. Присутствие белка А является видоспецифическим признаком золотистого стафилококка, однако в качестве продуцента чаще используют St. aures (штамм Cowan-1), наиболее богатый этим белком. При­готовление реагента для коагглютинации состоит в предваритель­ной обработке клеток для лучшего закрепления на их поверхно­сти белка А и предупреждения потери активности при длительном хранении суспензии.

Суточную агаровую культуру золотистого стафилококка засе­вают в жидкую пептонно-дрожжевую среду и выращивают в те­чение 12.„14 ч при усиленной аэрации (встряхивание на шуттельаппарате при 100 толчках в мин). Сокращенное время культиви­рования обеспечивает максимальное накопление белка А в клетках. Пептонно-дрожжевую среду готовят по следующей прописи:

пептон — 10 г, дрожжевой экстракт — 5 г, глюкоза — 2 г, двузамещенный фосфат калия — 3 г, дистиллированная вода — 1л. Среду стерилизуют в течение 30 мин при 0,05 МПа, рН после это­го составляет 7,2—7,4. Посевная доза — смыв с одного косяка на 2 л питательной среды.

Бактериальные клетки осаждают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и дважды отмывают от питатель­ной среды фосфатно-буферным раствором (ФБР) с рН 7,2.-.7,4. Из осадка готовят 10%-ную суспензию на ФБР. Эту суспензию мик­робов фиксируют 1%-ным раствором формальдегида в течение 3 ч при постоянном перемешивании. Затем бактериальные клетки четырежды отмывают ФБР от формальдегида, суспензию разво­дят до 10 %-ной концентрации и прогревают при 60 °С в течение 1 ч для снижения протеолитической активности. Затем клетки еще раз промывают, суспендируют в ФБР, добавляют мертиолят натрия (1:10000) и хранят до 2-х месяцев при 4...6 °С. Более дли­тельное хранение в жидком виде нежелательно, так как может снизиться активность белка А.

Необходимое условие успешной обработки стафилококко­вых клеток — проверка биологической активности белка А на всех этапах. Для этой цели предложено несколько препаратов. Все они представляют собой эритроциты или частицы латекса, сенсибилизированные гамма-глобулиновой фракцией сыворотки крови. По степени агглютинации нагруженных частиц определя­ют титр белка А. Достаточно активными считают стафилококко­вые препараты с титром 1:2000 и выше. Методика приготовления эритроцитарного диагностикума и постановкаРНГА— см. тему "РНГА ". Обработанные клетки золотистого стафилококка носят название "стафилококковый реагент".

Сенсибилизация стафилококков. Для получения коагглютинирующего реагента взвесь стафилококков обрабатывают им­мунной сывороткой против искомого объекта исследования. Сы­воротку следует брать от животного, IgG которого обладают срод­ством к белку А стафилококка. Наиболее активны по отно­шению к нему иммуноглобулины человека, свиньи, собаки и мор­ской свинки, менее — осла и кролика, а IgG овцы, лошади, козы, крысы и мыши взаимодействуют с ним очень слабо.

Сыворотка должна быть строго специфичной, т.е. не содер­жать антител к другим компонентам вируссодержащего материа­ла. Это достигается высокой степенью очистки вируса, исполь­зуемого для иммунизации, либо абсорбцией сыворотки неинфицированной культурой ткани, на которой получен вирус, либо сочетанием обоих этих методов.

Сыворотка, используемая в РКОА, не должна содержать ан­тител к стафилококку, так как это приводит к неспецифическим реакциям. Контроль проводят путем смешивания на стекле по 1 капле сыворотки и 10%-ной суспензии стафилококкового реа­гента. Если по истечении 3...5 мин не наблюдают образования хлопьев, то сыворотку считают пригодной для реакции.

Если образец сыворотки агглютинирует стафилококк, то проводят абсорбцию сывороток взвесью стафилококковых клеток, не имеющих белка А (например, штаммом Wood-46). Таким пу­тем удаляют антитела, реагирующие со стафилококком за счет Fab -фрагментов, не затрагивая специфических противовирусных антител, реагирующих с белком А за счет ГС-фрагментов. Аб­сорбцию проводят, смешивая равные объемы сыворотки и 10%-ной суспензии стафилококка штамма Wood-46. Смесь инку­бируют 30.„40 мин при 20...25 °С, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для сенсибилизации стафилококкового реагента.

Методика сенсибилизации стафилококков чрезвычайно про­ста, не требует специального оборудования и реактивов. Основное условие-подбор оптимальных доз и концентраций компонентов, т.е. сыворотки и стафилококкового реагента. Рассмотрим не­сколько вариантов приготовления коагглютинирующих реагентов для различных вирусных объектов.

Для идентификации вируса гриппа смешивают равные объ­емы иммунной кроличьей сыворотки в разведении 1:20 и 10%-ной суспензии стафилококкового реагента. Смесь инкубиру­ют при 20...25 °С в течение30 мин, затем дважды отмывают ФБР, доводят суспензию до концентрации 0,5% и консервируют 0,1%-ным раствором азида натрия- Полученный реагент может храниться несколько месяцев.

Для идентификации ротавирусов смешивают 0,3 мл нераз­веденной иммунной кроличьей сыворотки и 0,4 мл 50%-ной сус­пензии стафилококкового реагента. Смесь инкубируют при 25 °С в течение 5 мин, затем отмывают и готовят 2%-ную суспензию.

Постановка реакции и учет результатов. В отличие от бактериальных объектов, где можно использовать чистую куль­туру, вирусы всегда определяют в каком-либо биологическом ма­териале. В этом случае для исключения неспецифических реак­ций необходимо провести абсорбцию этого материала суспензией стафилококка. Для этого смешивают равные объемы 10%-ной взвеси стафилококкового реагента и испытуемого материала, в котором предполагается наличие вируса. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин, центрифугируют и надосадочную жид­кость используют в РКОА.

Постановка РКОА состоит в смешивании на стекле равных объемов испытуемого материала и коагглютинирующего реагента. Результаты реакции учитывают визуально на темном фоне после 2..-3 мин интенсивного перемешивания. Темный фон — необхо­димое условие учета реакции, так как при наблюдении в прохо­дящем свете может быть заметна мелкодисперсная агглютинация стафилококковых клеток. Реакцию учитывают по 3-х балльной системе:

+++ — интенсивное просвечивание реакционной смеси с об­разованием хлопьев (резко положительная реакция);

++ — отчетливое просветление смеси (положительная реак­ция);

+ — еле заметное просветление смеси (слабо положительная реакция);

- — отсутствие просветления (отрицательная реакция). Каждый опыт сопровождают следующими контролями: 1) стафилококковый реагент, сенсибилизированный нормальной (или гетерологичной) сывороткой + испытуемый материал; 2) ис­пользуемый коагглютинирующий реагент + материал, заведомо не содержащий вируса; 3) коагглютинирующий реагент + фосфатнобуферный раствор; 4) испытуемый материал + фосфатно-буферный раствор. Все контроли должны проработать отрица­тельно.

Модификации постановки РКОА:

1) прямой метод. Коагглютинирующим реагентом обраба­тывают инфицированную культуру клеток в течение 30 мин при 20 °С. Затем смесь отмывают и исследуют под микроскопом. Во­круг инфицированных клеток отчетливо виден "ореол" стафило­кокка, что свидетельствует о наличии вирусных антигенов;

2) непрямой метод. На культуру клеток, инфицированную вирусом, наносят иммунную сыворотку, а затем — стафилокок­ковый реагент. Остальные этапы проводят аналогично прямому методу. Непрямой метод позволяет диагностировать вирусную инфекцию клеток уже через 12 ч после инфицирования, тогда как прямой метод — через 18 ч.

Специфичность РКОА контролируют путем постановки ре­акции в следующих системах: 1) инфицированные клетки + нор­мальная кроличья сыворотка + стафилококковый реагент; 2) не­инфицированные клетки + иммунная сыворотка + стафилококковый реагент. Наличие агглютинации в опытной системе и отсутствие ее в двух контрольных свидетельствует о специфичности реакции.

При соблюдении всех требований к иммунным сывороткам, а также оптимальных условий сенсибилизации РКОА высокоспе­цифична—наблюдается 1-2 % ложноположительных результатов. Чувствительность этой реакции достаточно высока. Она не усту­пает иммунологическим методам "третьего поколения" (РИМ, ИФМ и др.) и значительно превосходит некоторые реакции "вто­рого поколения".

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 638 | Нарушение авторских прав