АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Полимеразная цепная реакция. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) теоретически позволяет обнаружить в пробе всего одну молекулу ДНК

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) теоретически позволяет обнаружить в пробе всего одну молекулу ДНК. Принцип метода основан на многократном увеличении числа копий искомого участка ДНК, достаточного для достоверной визуализации. Амплификацию (умножение) нуклеотидной последовательности ДНК катализирует ДНК–полимераза. Процесс репликации искомого фрагмента ДНК обуславливают ген-специфические праймеры ¾ ДНК–олигонуклеотиды, каждый из которых комплементарен одной из двух цепей молекулы ДНК (рис. 1-11). Праймеры (20–30 нуклеотидных пар) служат затравками для ДНК–полимеразы при синтезе комплементарной цепи ДНК. Длина амплифицируемого участка синтезируемой ДНК ограничена праймерами и обычно составляет несколько сот пар нуклеотидов. При этом каждая вновь синтезированная цепь ДНК (амплификон) служит матрицей для синтеза новой цепи комплементарной ДНК. Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК требуется от 20 до 30 циклов ПЦР, характеризующихся экспоненциальным увеличением числа копий специфического фрагмента ДНК. Каждый цикл реакции включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах.

Ú 1 этап (денатурация). Нагревание ДНК до 95 °C, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

Ú 2 этап (отжиг). Гибридизация праймеров при 55–60 °C с комплементарными последовательностями на противоположных цепях ДНК (на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента).

Ú 3 этап (элонгация). При температуре 68–72 °C праймеры в присутствии ДНК–полимеразы и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов служат затравками для синтеза новой цепи ДНК.

Рис. 1-11. Полимеразная цепная реакция. Специфическая пара праймеров служит затравкой для амплификации искомого фрагмента ДНК. Один из праймеров (светлая стрелка) обеспечивает синтез ДНК от правой границы амплифицируемого фрагмента, а второй (чёрная стрелка)¾ от левой. При этом каждая вновь синтезированная цепь ДНК является матрицей для дальнейшего синтеза ДНК. Поэтому с каждым циклом реакции происходит экспоненциальный рост количества копий искомого фрагмента ДНК. [123]

Процесс амплификации проводится в программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации. Материалом для выявления фрагмента ДНК, специфичного для наследственного или инфекционного заболевания могут служить биопсия, кровь, аспираты, носоглоточные смывы, соскобы из зева, мокрота, моча, эякулят, мазки, спинно-мозговая жидкость, амниотическая жидкость и даже законсервированные (например, парафинизированные) образцы органов и тканей. Для санитарно-эпидемиологического надзора важно то, что для ПЦР доступно исследование проб воды, почвы и образцов пищевых продуктов. В судебной медицине ПЦР позволяет провести идентификацию личности путём генотипирования любого биологического материала, поскольку ДНК сохраняет свою стабильность длительное время (например ДНК, экстрагированная из костной ткани). Генспецифические праймеры создают при помощи компьютерных программ, использующих информацию о нуклеотидной последовательности известных генов микроорганизмов или генов человека, предоставленных на сайтах GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/) и EMBL(www.ebi.ac.uk/embl.html).

Полимеразная цепная реакция в классическом формате. Применяют для выявления локусов предполагаемых мутаций ДНК и ДНК–содержащих микроорганизмов. Из исследуемого материала экстрагируют геномную ДНК, искомый фрагмент которой амплифицируют с помощью ген-специфических праймеров. Конечный результат реакции свидетельствует о присутствии ДНК–мишени в исследуемом материале (например, ДНК вируса гепатита С, мутированный ген супероксиддисмутазы 1 при наследственной форме бокового амиотрофического склероза).

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией. Для выявления специфических участков генома РНК–содержащих вирусов или исследования транскрипции гена-мишени (синтеза информационной РНК) сначала получают ДНК–копию с РНК–матрицы (информационной РНК), используя реакцию обратной транскрипции, катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой). Синтезированные таким образом комплементарные ДНК (кДНК) служат матрицами для ген-специфических праймеров в ПЦР. Положительная ПЦР с праймерами, комплементарными специфической вирусной РНК, доказывает присутствие данного вируса в исследуемом материале. Обнаружение информационной РНК мутированного гена в образце ткани свидетельствует о транскрипции данного гена, т.е. его функциональной активности. Метод позволяет ответить на вопрос, работает или молчит определённый ген.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Показателем уровня экспрессии гена служит концентрация соответствующей информационной РНК. Метод ПЦР в реальном времени даёт возможность не только обнаружить в исследуемой ткани разрешённый к экспрессии ген, но и по динамике изменения концентрации информационной РНК количественно оценить активность этого гена. Из исследуемого материала экстрагируют РНК и с помощью обратной транскриптазы синтезируют комплементарные ДНК. Далее с кДНК–матрицы (реплика информационной РНК) в присутствии ген-специфических праймеров и ДНК–полимеразы выполняют ПЦР. В ходе реакции каждый амплифицируемый фрагмент включает флюоресцентную метку. По характеру включения метки специальные компьютерные программы позволяют определить абсолютное количество молекул мРНК в ткани и таким образом оценить степень функциональной активности гена.

Дата добавления: 2015-05-19 | Просмотры: 668 | Нарушение авторских прав