АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение активности амилаз солода

(по массе гидролизованного крахмала)

Действие амилаз на крахмал можно установить либо по убыли крахмала, либо по накоплению продуктов его распада – сахара.

Метод определения активности амилаз по массе расщепленного крахмала получил название колориметрического.

Принцип метода состоит в том, что активность амилаз рассчитывают по разности между массами взятого для опыта и оставшегося по окончании опыта нерасщепленным крахмала, определяемого фотометрическим анализом по цветной реакции с йодом. При проведении опыта продолжительность инкубации и объем раствора ферментного препарата устанавливают такими, чтобы в опытных пробирках (содержащих фермент) не произошел полный гидролиз крахмала.

Данный метод позволяет установить специфичность и активность совместного действия амилаз на крахмал. α-Амилаза (КФ 3.2.1.1.) гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах α-1,4-гликозидные связи без определенного порядка. В результате образуются декстрины и незначительное количество мальтозы. β-Амилаза (КФ 3.2.1.2.) гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах α-1,4-гликозидные связи, последовательно отщепляя молекулы мальтозы с нередуцирующих концов цепочек.

Наиболее эффективно гидролиз осуществляется под действием комплекса амилаз, содержащихся в вытяжке из солода.

Ход работы. Для проведения опыта берут 6 пробирок, одна из них контрольная. Пробирки заполняют в соответствии с табл. 2.1.

Содержимое в пробирках перемешивают и ставят в термостат при 37-38 ºС на 30 мин. Такая постановка опыта позволяет одновременно определить суммарную активность амилаз в солодовой вытяжке (α- и β-амилаз вместе), активность α-амилазы и активность β-амилазы. По окончании времени инкубации пробирки из термостата вынимают и в каждую немедленно добавляют по 2 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 1 моль/л и по 3 капли водного раствора йода; содержимое перемешать.

Таблица 2.1

Определение активности амилаз солода

Пробирки с содержимым, окрашенным в желтые тона, убирают. Пробирки с содержимым, окрашенным в синие, фиолетовые или красные тона оставляют для дальнейшей работы (если после добавления раствора йода все пробирки с одним и тем же ферментным препаратом будут окрашены в желтый цвет, то опыт следует повторить, взяв этот ферментный препарат в меньшем количестве).

Берут мерные колбы вместимостью 50 мл, нумеруют их соответственно номерам, оставленных для дальнейшей работы пробирок. В каждую колбу вносят 30-40 мл воды, 0,5 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 1 моль/л, 10 капель водного раствора йода и 0,5 мл смеси из пробирки в соответствии с номером колбы. Непосредственно перед отбором смеси содержимое пробирки перемешивают. Содержимое колбы доводят до метки водой, перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при красном светофильтре против воды.

Активность амилаз выражают в мг расщепленного крахмала на 1 г солода (или другого материала) за 1 мин. Расчет производят следующим образом:

- определяют массу расщепленного крахмала по формуле:

Е_к – Е_о

m = • С,

Е_к

где, m – масса расщепленного крахмала за время опыта, мг;

Е_к – оптическая плотность контрольного раствора;

Е_о – оптическая плотность опытного раствора;

С – масса внесенного крахмала, мг (3 мл раствора с массовой долей крахмала 2 % содержат 60 мг крахмала);

- полученный результат умножают на разбавление (см. табл. 15), т.е. приводят к 1 мл исходной ферментной вытяжки и затем делят на время инкубации (30 мин), что позволяет выразить активность амилазы в мг расщепленного крахмала 1 мл ферментной вытяжки за 1 мин.

Зная методику приготовления вытяжки из биологического объекта, можно легко рассчитать активность амилазы в мг расщепленного крахмала на 1 г биологического материала за 1 мин по формуле:

(Е_к – Е_о)• 60 •V

А =,

Е_к• V₁• m• 30

где, А – активность амилазы в мг расщепленного крахмала на 1 г солода (или другого материала) за 1мин;

Е_к – оптическая плотность контрольного раствора;

Е_о – оптическая плотность опытного раствора; 60 – масса взятого для анализа крахмала, мг (в 3 мл 2 % раствора содержится 60 мг крахмала);

V – общий объем солодовой вытяжки, полученной из солода (100 мл);

V₁ – объем ферментного препарата, взятого для инкубирования, мл;

30 – время инкубации, мин;

m – масса солода, взятого для приготовления солодовой вытяжки.

При расчете активности β-амилазы в числитель необходимо ввести число 2,4, которое учитывает все разведения солодовой вытяжки, сделанные при выделении β-амилазы.

Результаты исследований записывают и делают выводы об активности амилаз солода.

Контрольные вопросы.

1. Общая характеристика солода.

2. Какие ферменты содержатся в солоде и как их можно выделить?

3. Техника выделения α-амилазы. На чем она основана?

4. Метод выделения β-амилазы, на чем он основан?

5. Специфичность действия и активность α-амилазы.

6. Специфичность действия и активность β-амилазы.

7. Принцип колориметрического метода определения активности амилаз? Что положено в основу?

8. Расчет активности и характеристика полученных результатов.

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 1013 | Нарушение авторских прав