АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение активности каталазы

( по А.Н. Баху и А.И. Опарину )

Оксидоредуктазы – класс ферментов катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Окисление мономеров, образующихся в процессе катаболизма полимеров, представляет собой сложный многоступенчатый процесс.

Окисление веществ в клетках протекает, в основном, путем отщепления водорода (дегидрированием) или отщеплением электронов или путем присоединения кислорода к молекуле окисляемого соединения.

Акцепторами водорода у дегидрогеназ является НАД⁺, НАДФ, ФАД и ФМН, у некоторых флавиновых – кислород (их называют оксидазами), у гемсодержащих (пероксидаз и каталазы) – Н₂О₂ (пероксид водорода).

Акцепторами и переносчиками электронов являются цитохромы, содержащие гем (гемопротеины).

Каталаза (КФ 1.11.1.6) относится к гемопротеинам, катализирует процесс разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород:

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂.

Для живой клетки пероксид водорода является сильным ядом, поэтому все ферменты образующие и обезвреживающие Н₂О₂ находятся в пероксисомах – органеллах покрытых мембраной. Главными потребителями Н₂О₂ являются пероксидазы (КФ 1.11.1.7.), которые окисляют фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения и др. субстраты дегидрированием, переносят снятые с субстратов [2Н] на Н₂О₂, восстанавливая его до 2Н₂О. Молекулы пероксида водорода, невостребованные пероксидазами, обезвреживаются каталазой.

Метод определения активности каталазы основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество H₂O₂ в реакционной смеси определяют титрованием в кислой среде раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л:

5 H₂O₂ + 2KMnO₄ + 3H₂SO₄ → 2MnSO₄ + K₂SO₄ + 5O₂ +8H₂O

На основании приведенного уравнения реакции можно рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л соответствует 1,7 мг (50 мкмоль) пероксида водорода.

Реактивы. Вода дистиллированная; кальций углекислый (порошок); раствор с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л; растворы с массовыми долями: пероксида водорода 1 % (10 мл раствора с массовой долей H₂O₂ 30 % разбавить водой до 300 мл), серной кислоты 10 %.

Ход работы. 2-3 г сырого картофеля (или другого свежего растительного материала) тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклом. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике скальпеля CaCO₃ до прекращения выделения пузырьков СО₂. В процессе растирания в ступку добавляют небольшими порциями 40-50 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Смесь оставляют стоять 10-15 мин и после перемешивания фильтруют.

Берут две конические колбочки вместимостью 150-200 мл и вносят в них по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы кипятят в течение 1 мин и охлаждают до комнатной температуры (контроль). Другая колба опытная содержит активный фермент. К содержимому опытной и контрольной колб приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора с массовой долей H₂O₂ 1 %. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании инкубации в обе колбы добавляют по 5 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 %, перемешивают и избыток H₂O₂ в каждой колбе оттитровывают раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л до образования розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.

Активность каталазы выражают в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчете на 1 г исследуемого материала (или на 1 мг вытяжки из него) за 1 мин. Вычисление ведут по формуле:

,

где, Х – активность каталазы, Е/г;

(а-b) – разность между объемами раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л, пошедшего на титрование контрольной (а) и опытной (b) проб, мл;

Т – титр примененного для титрования раствора перманганата калия;

50 – коэффициент пересчета на мкмоль H₂O₂;

100 – общий объем приготовленного экстракта;

m – масса взятого для анализа материала, г;

20 – объем фильтрата, взятого для анализа, мл;

30 – время инкубации, мин.

Принцип определения, порядок анализа и результат анализа записывают.

Активность каталазы можно определить и по объему кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому объекту H₂O₂.

Этот принцип используют для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объем кислорода (мл) выделившийся за 2 часа при 25 °С из добавленных к 15 мл молока 5 мг раствора с массовой долей H₂O₂ 1 %. Молоко, полученное от здоровых животных, выделяет 0,7-2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенные каталазные числа, достигающие до 15.

Контрольные вопросы.

1. Основные пути окисления субстратов в клетке.

2. Характеристика строения и действия НАД⁺- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ.

3. Характеристика строения и действия ФАД-зависимых дегидрогеназ.

4. Какие ферменты называют оксидазами? Их кофакторы.

5. Характеристика строения и действия пероксидаз и каталаз.

6. Характеристика строения и действия цитохромов.

7. Химизм, образование и пути обезвреживания пероксида водорода в клетках.

8. Метод определения активности каталазы.

Лабораторная работа № 9

Определение активности протеолитических ферментов

Протеолитические ферменты катализируют расщепление белковых веществ до пептидов и дальнейший гидролиз этих продуктов где R₁ и R₂ - остатки аминокислот или псптадов.

Протеазы делятся на две группы - протеиназы и пептидазы.

Петидазы обладают очень большой специфичностью дейстаия и делятся на три группы: аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы. Аминопептидазы катализируют расщепление полипептидов по месту пептидной связи, расположенной у того конца пептида, на котором имеется свободная аминная группа:

где R₁, R₂ и R₃ - остатки аминокислот;

стрелкой показано место действия аминопептидазы.

Карбоксипетидаза расщепляет в полипептидах пептидную связь у того конца пептида, где имеется свободная карбоксильная группа;

где R₁, R₂ и R₃ - остатки аминокислот;

стрелкой показано действие карбоксипептидазы.

Во всех продуктах растительного происхождения протеиназы и пептидазы присутствуют вместе, поэтому гидролиз белка происходит до конца (до аминокислот).

Определить активность протеолитических ферментов можно следующими способами:

- автолизом, когда навеску исследуемого материала заливают водой, прибавляют антисептик (например, тимол или толуол) и под влиянием ферментов, находящихся в клетках этого же растительного материала, собственный белок расщепляется до аминокислот. Распад белков и продуктов их гидролиза происходят по месту пептидных связей по следующей схеме:

- действием вытяжки фермента на препарат белка или какой-либо другой субстрат.

- выделением ферментов из растительных тканей, очисткой этих ферментов и определением их действия на белки или препаратов растительных тканей. Чаще всего активность протеолитических ферментов определяют более простым первым методом.

Активность протеаз учитывают обычно по количеству освоождающихся аминных или карбоксильных групп б навеске материала за определенный отрезок времени. Определение аминных групп можно проводить методом Ван-Сляйка или методом Несслера.

Приборы и реактивы: колбы конические на 100 мл, колбы мерные на 100 мл; фосфатный буфер 1/15 М с рН 5,6 (0,5 мл 1/5 М Nа₂НРО₄ и 9,5 мл 1/15 М КН₂РО₄); толуол, реактив Несслера (растворяют 25 г йодистого калия в 50 мл воды, прибавляют 35 г йодистой ртути красной и в фарфоровой ступке пестиком растирают до полного растворения. Прибавляют 870 мл 15 %-ного раствора КОН. перемещивают, дают отстояться и декантируют прозрачную жид кость. Раствор хранят в темной склянке); сегнетова соль 25%-ная; образцовый раствор NH₄Cl (0,7405 г х.ч. перекристаллизоваиного хлорида ам.чоиия растворяют в дистиллированной безаммиачной воде и доводят объем до 1 л, 20 мл этого раствора переносят в мерную колбу на 1 л, доводят объем до метюки, 1 мл этого раствора содержит 0,005 мг NH₄⁺).

Ход работы: Навеску 10 г муки помешают в коническую колбу емкостью 100 мл, приливают 50 мл дистиллированной воды, 20 мл фосфатного буфера (рН 5,6), 0,5 мл толуола.

При изучении активности ферментов в зависимости от температуры колбы с буфером выдерживают при различных температурах (3-8 °С, 16-24 °С, 35 °С, 50 °С) в течение 24 часов.

Обязательно ставят контрольную колбу с инактивированными ферментами. Инактивацию проводят кипячением содержимого колбы в течение 3-5 минут.

После соответствующей экспозиции колбы вынимают из термостата, фильтруют в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки водой и 10 мл раствора используют для определения аминного азота методом Несслера.

10 мл раствора помещают в мерную колбу на 100 мл, добавляют воды до половины объема, затем приливают 4 мл 25 %-ного раствора сегнетовой соли н перемешивают. Снова доводят общий объем в колбе водой до 90 мл и приливают 4 мл реактива Несслера.

После этого доводят объем до метки. Периодическое разбавление опытного раствора при добавлении реактива Несслера обеспечивает получение прозрачного раствора чисто-желтого цвета.

Содержание в растворе аммония устанавливают по калибровочной кривой образцовых растворов. Для построения ее готовят образцовые растворы одновременно с испытуемым раствором. В мерные колбы на 100 мл помещают 0,5; 1; 2; 4 мл рабочего образцового раствора хлористого аммония, добавляют воды до половины объема, а затем раствор сегнетовой соли и реактив Несслера.

Просмотр окраскл образцового и испытуемого растворов проводят через 10 минут прибавления реактива Несслера при длине волны X = 400 нм.

Содержание аммонийного азота (%) рассчитывают по формуле:

где а - количество азота по графику, мг,

в - общий объем раствора, мл (500);

с - объем раствора, взятый для окрашивания, мл;

н - навеска воздушно-сухого материала, г;

1000 - перевод мг в г

Полученные результаты записывают в таблицу 9.1.

Таблица 9.1

Результаты экспериментов

Контрольные вопросы.

1. Дайте классификацию протеолитических ферментов.

2. Что является субстратом для действия протеаз?

3. Каковы продукты гидролиза белков?

4. В чем заключается значение протеаз для пищевой промышленности?

5. Какие вам известны ферментные препараты протеолитического действия?

6. Какова сущность метода определения активности протеолитических ферментов?

Литература

1. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. - Киев.: Наукова думка, 1987. -239 с.

2. Конарева В.Г. Белки пшеницы. - М.: Колос, 1980. - 363 с.

3. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. - М.: Наука, 1971.-291 с.

4. Применение новых ферментных препаратов в хлебопекарном производстве. - М.: Пищевая промышленность, 1988. - 342 с.

5. Салманова Л.С. Цитолитические ферменты в пищевой промышленности. - М.: Пищевая промышленность, 1982. - 204 с.

6. Ферменты (основы химии и технологии). - Киев.: Техника, 1971,-360 с.

7. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.

8. Микробные ферменты и биотехнология. - М.: Пищевая промышленность, 1986. - 318 с.

9. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. - Колос, 1968. - 183 с.

10. Ферментные препараты в пищевой промышленности. - М.; Пищевая промышленность, 1975. - 198 с.

11. Яровенко В.А. Ферментные препараты в пищевой промышленности. - М.: Пищевая промышленность, 1975. - 183 с.

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 1644 | Нарушение авторских прав