АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение активности каталазы

Прочитайте:
  1. C. повышение цитотоксической активности Т-лимфоцитов
  2. E. повышение ферментативной активности лизосом
  3. E. снижения активности фермента глутатионпероксидазы
  4. I. Определение верхушечного толчка.
  5. I.1. Определение понятия
  6. II) Энзимологическое определение количества метаболитов.
  7. III. Виды реактивности
  8. IV. Роль реактивности организма в возникновении и развитии опухолевого процесса.
  9. IV.1. Дыхательная недостаточность. Определение понятия
  10. А) Определение силы неизвестного анатоксина по известной антитоксической сыворотке

( по А.Н. Баху и А.И. Опарину )

 

Оксидоредуктазы – класс ферментов катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Окисление мономеров, образующихся в процессе катаболизма полимеров, представляет собой сложный многоступенчатый процесс.

Окисление веществ в клетках протекает, в основном, путем отщепления водорода (дегидрированием) или отщеплением электронов или путем присоединения кислорода к молекуле окисляемого соединения.

Акцепторами водорода у дегидрогеназ является НАД+, НАДФ, ФАД и ФМН, у некоторых флавиновых – кислород (их называют оксидазами), у гемсодержащих (пероксидаз и каталазы) – Н2О2 (пероксид водорода).

Акцепторами и переносчиками электронов являются цитохромы, содержащие гем (гемопротеины).

Каталаза (КФ 1.11.1.6) относится к гемопротеинам, катализирует процесс разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород:

 

2 H2O2 → 2 H2O + O2.

 

Для живой клетки пероксид водорода является сильным ядом, поэтому все ферменты образующие и обезвреживающие Н2О2 находятся в пероксисомах – органеллах покрытых мембраной. Главными потребителями Н2О2 являются пероксидазы (КФ 1.11.1.7.), которые окисляют фенолы, амины, некоторые гетероциклические соединения и др. субстраты дегидрированием, переносят снятые с субстратов [2Н] на Н2О2, восстанавливая его до 2Н2О. Молекулы пероксида водорода, невостребованные пероксидазами, обезвреживаются каталазой.

Метод определения активности каталазы основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество H2O2 в реакционной смеси определяют титрованием в кислой среде раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л:

 

5 H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 5O2 +8H2O

 

На основании приведенного уравнения реакции можно рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л соответствует 1,7 мг (50 мкмоль) пероксида водорода.

Реактивы. Вода дистиллированная; кальций углекислый (порошок); раствор с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л; растворы с массовыми долями: пероксида водорода 1 % (10 мл раствора с массовой долей H2O2 30 % разбавить водой до 300 мл), серной кислоты 10 %.

 

Ход работы. 2-3 г сырого картофеля (или другого свежего растительного материала) тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклом. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике скальпеля CaCO3 до прекращения выделения пузырьков СО2. В процессе растирания в ступку добавляют небольшими порциями 40-50 мл воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят водой до метки и перемешивают. Смесь оставляют стоять 10-15 мин и после перемешивания фильтруют.

Берут две конические колбочки вместимостью 150-200 мл и вносят в них по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы кипятят в течение 1 мин и охлаждают до комнатной температуры (контроль). Другая колба опытная содержит активный фермент. К содержимому опытной и контрольной колб приливают по 20 мл воды и по 3 мл раствора с массовой долей H2O2 1 %. Содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. По окончании инкубации в обе колбы добавляют по 5 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 %, перемешивают и избыток H2O2 в каждой колбе оттитровывают раствором с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л до образования розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.

Активность каталазы выражают в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчете на 1 г исследуемого материала (или на 1 мг вытяжки из него) за 1 мин. Вычисление ведут по формуле:

 

,

 

где, Х – активность каталазы, Е/г;

(а-b) – разность между объемами раствора с концентрацией перманганата калия 0,02 моль/л, пошедшего на титрование контрольной (а) и опытной (b) проб, мл;

Т – титр примененного для титрования раствора перманганата калия;

50 – коэффициент пересчета на мкмоль H2O2;

100 – общий объем приготовленного экстракта;

m – масса взятого для анализа материала, г;

20 – объем фильтрата, взятого для анализа, мл;

30 – время инкубации, мин.

 

Принцип определения, порядок анализа и результат анализа записывают.

Активность каталазы можно определить и по объему кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому объекту H2O2.

Этот принцип используют для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объем кислорода (мл) выделившийся за 2 часа при 25 °С из добавленных к 15 мл молока 5 мг раствора с массовой долей H2O2 1 %. Молоко, полученное от здоровых животных, выделяет 0,7-2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенные каталазные числа, достигающие до 15.

 

Контрольные вопросы.

1. Основные пути окисления субстратов в клетке.

2. Характеристика строения и действия НАД+- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ.

3. Характеристика строения и действия ФАД-зависимых дегидрогеназ.

4. Какие ферменты называют оксидазами? Их кофакторы.

5. Характеристика строения и действия пероксидаз и каталаз.

6. Характеристика строения и действия цитохромов.

7. Химизм, образование и пути обезвреживания пероксида водорода в клетках.

8. Метод определения активности каталазы.

 

 


 

Лабораторная работа № 9

 

Определение активности протеолитических ферментов

 

Протеолитические ферменты катализируют расщепление белковых веществ до пептидов и дальнейший гидролиз этих продуктов где R1 и R2 - остатки аминокислот или псптадов.

Протеазы делятся на две группы - протеиназы и пептидазы.

Петидазы обладают очень большой специфичностью дейстаия и делятся на три группы: аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы. Аминопептидазы катализируют расщепление полипептидов по месту пептидной связи, расположенной у того конца пептида, на котором имеется свободная аминная группа:

 

 

где R1, R2 и R3 - остатки аминокислот;

стрелкой показано место действия аминопептидазы.

 

Карбоксипетидаза расщепляет в полипептидах пептидную связь у того конца пептида, где имеется свободная карбоксильная группа;

 

 

где R1, R2 и R3 - остатки аминокислот;

стрелкой показано действие карбоксипептидазы.

 

Во всех продуктах растительного происхождения протеиназы и пептидазы присутствуют вместе, поэтому гидролиз белка происходит до конца (до аминокислот).

Определить активность протеолитических ферментов можно следующими способами:

- автолизом, когда навеску исследуемого материала заливают водой, прибавляют антисептик (например, тимол или толуол) и под влиянием ферментов, находящихся в клетках этого же растительного материала, собственный белок расщепляется до аминокислот. Распад белков и продуктов их гидролиза происходят по месту пептидных связей по следующей схеме:

 

- действием вытяжки фермента на препарат белка или какой-либо другой субстрат.

- выделением ферментов из растительных тканей, очисткой этих ферментов и определением их действия на белки или препаратов растительных тканей. Чаще всего активность протеолитических ферментов определяют более простым первым методом.

Активность протеаз учитывают обычно по количеству освоождающихся аминных или карбоксильных групп б навеске материала за определенный отрезок времени. Определение аминных групп можно проводить методом Ван-Сляйка или методом Несслера.

Приборы и реактивы: колбы конические на 100 мл, колбы мерные на 100 мл; фосфатный буфер 1/15 М с рН 5,6 (0,5 мл 1/5 М Nа2НРО4 и 9,5 мл 1/15 М КН2РО4); толуол, реактив Несслера (растворяют 25 г йодистого калия в 50 мл воды, прибавляют 35 г йодистой ртути красной и в фарфоровой ступке пестиком растирают до полного растворения. Прибавляют 870 мл 15 %-ного раствора КОН. перемещивают, дают отстояться и декантируют прозрачную жид кость. Раствор хранят в темной склянке); сегнетова соль 25%-ная; образцовый раствор NH4Cl (0,7405 г х.ч. перекристаллизоваиного хлорида ам.чоиия растворяют в дистиллированной безаммиачной воде и доводят объем до 1 л, 20 мл этого раствора переносят в мерную колбу на 1 л, доводят объем до метюки, 1 мл этого раствора содержит 0,005 мг NH4+).

Ход работы: Навеску 10 г муки помешают в коническую колбу емкостью 100 мл, приливают 50 мл дистиллированной воды, 20 мл фосфатного буфера (рН 5,6), 0,5 мл толуола.

При изучении активности ферментов в зависимости от температуры колбы с буфером выдерживают при различных температурах (3-8 °С, 16-24 °С, 35 °С, 50 °С) в течение 24 часов.

Обязательно ставят контрольную колбу с инактивированными ферментами. Инактивацию проводят кипячением содержимого колбы в течение 3-5 минут.

После соответствующей экспозиции колбы вынимают из термостата, фильтруют в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки водой и 10 мл раствора используют для определения аминного азота методом Несслера.

10 мл раствора помещают в мерную колбу на 100 мл, добавляют воды до половины объема, затем приливают 4 мл 25 %-ного раствора сегнетовой соли н перемешивают. Снова доводят общий объем в колбе водой до 90 мл и приливают 4 мл реактива Несслера.

После этого доводят объем до метки. Периодическое разбавление опытного раствора при добавлении реактива Несслера обеспечивает получение прозрачного раствора чисто-желтого цвета.

Содержание в растворе аммония устанавливают по калибровочной кривой образцовых растворов. Для построения ее готовят образцовые растворы одновременно с испытуемым раствором. В мерные колбы на 100 мл помещают 0,5; 1; 2; 4 мл рабочего образцового раствора хлористого аммония, добавляют воды до половины объема, а затем раствор сегнетовой соли и реактив Несслера.

Просмотр окраскл образцового и испытуемого растворов проводят через 10 минут прибавления реактива Несслера при длине волны X = 400 нм.

Содержание аммонийного азота (%) рассчитывают по формуле:

 

где а - количество азота по графику, мг,

в - общий объем раствора, мл (500);

с - объем раствора, взятый для окрашивания, мл;

н - навеска воздушно-сухого материала, г;

1000 - перевод мг в г

 

Полученные результаты записывают в таблицу 9.1.

 

Таблица 9.1

Результаты экспериментов

Образец Температура воздействия, °С Показания прибора Количество азота по графику, мг Содержание азота, %
Контрольный        
Опытный        

 

Контрольные вопросы.

1. Дайте классификацию протеолитических ферментов.

2. Что является субстратом для действия протеаз?

3. Каковы продукты гидролиза белков?

4. В чем заключается значение протеаз для пищевой промышленности?

5. Какие вам известны ферментные препараты протеолитического действия?

6. Какова сущность метода определения активности протеолитических ферментов?

 


 

Литература

 

1. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. - Киев.: Наукова думка, 1987. -239 с.

2. Конарева В.Г. Белки пшеницы. - М.: Колос, 1980. - 363 с.

3. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. - М.: Наука, 1971.-291 с.

4. Применение новых ферментных препаратов в хлебопекарном производстве. - М.: Пищевая промышленность, 1988. - 342 с.

5. Салманова Л.С. Цитолитические ферменты в пищевой промышленности. - М.: Пищевая промышленность, 1982. - 204 с.

6. Ферменты (основы химии и технологии). - Киев.: Техника, 1971,-360 с.

7. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.

8. Микробные ферменты и биотехнология. - М.: Пищевая промышленность, 1986. - 318 с.

9. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. - Колос, 1968. - 183 с.

10. Ферментные препараты в пищевой промышленности. - М.; Пищевая промышленность, 1975. - 198 с.

11. Яровенко В.А. Ферментные препараты в пищевой промышленности. - М.: Пищевая промышленность, 1975. - 183 с.

 


Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 1646 | Нарушение авторских прав



1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |



При использовании материала ссылка на сайт medlec.org обязательна! (0.01 сек.)