АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Лабораторная работа № 2

Выделение α- и β- амилаз из солода и определение их активности

В солоде (проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя) содержатся активные α- и β- амилазы. Они хорошо растворяются в воде, поэтому их можно получить в виде водной вытяжки.

Выделение α- и β- амилазы из солодовой водной вытяжки основано на различной устойчивости этих ферментов к температуре и рН среды. При нагревании солодовой вытяжки до 70 ºС β-амилаза денатурирует, тогда как α-амилаза при этой температуре сохраняет нативную конформацию и активность. Оптимум действия β-амилазы проявляется при рН 4,8, однако α-амилаза при таких значениях рН теряет свою активность, а при понижении до рН 3,3 – денатурирует.

Реактивы. Вода дистиллированная; вытяжка из солода; ацетатный буфер pH 5,5 (к 57,4 мл раствора с концентрацией уксусной кислоты 1 моль/л добавляют 50 мл раствора с концентрацией гидроксида натрия 1 моль/л и общий объем доводят водой до 500 мл); раствор с массовой долей крахмала 2 % (суспензируют 2 г растворимого крахмала в 20мл холодной воды, затем при помешивании добавляют 80 мл кипящей воды и кипятят 1 мин, после охлаждения объем доводят водой до 100 мл и содержимое перемешивают); раствор с концентрацией соляной кислоты 1 моль/л; раствор с массовой долей йода 0,3 % в растворе с массовой долей йодида калия 3 % (0,3 г йода кристаллического и 3 г йодида калия смешивают с 3-5 мл воды и после растворения йода объем доводят водой до 100 мл).

Приготовление вытяжки из солода. 20 г измельченного солода растирают в ступке с небольшим количеством воды до однородной массы и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл объем доводят водой до метки, содержимое перемешивают и оставляют на льду на 2 часа (можно поставить в холодильник на ночь). По истечении времени экстрагирования содержимое перемешивают и центрифугируют в течении 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Центрифугат используют в качестве источника амилазы.

Выделение α-амилазы. В пробирку вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют на кончике ножа порошок ацетата кальция и пробирку выдерживают в течении 15 мин. на водяной бане, нагретой до 68 ºС (в период нагревания температура воды не должна подниматься выше 70 ºС и опускаться ниже 66 ºС). Затем содержимое пробирки охлаждают холодной водой. При таком прогревании β-амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза сохраняет свою активность. Полученный раствор используют для определения активности α-амилазы.

Выделение β-амилазы. В колбу вместимостью 50 мл вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют 4 мл воды, 1 мл раствора с концентрацией соляной кислоты равной 0,1 моль/л (рН полученной смеси должен быть 3,3). Затем колбу с содержимым помещают на 15 мин на снег или лед (можно в морозильную камеру холодильника). В этих условиях α-амилаза полностью инактивируется, а β-амилаза сохраняет свою активность. По истечении 15 мин выдержки на холоде к содержимому колбы добавляют 2 мл раствора с концентрацией гидрофосфата натрия (Na₂HPO₄) 0,15 моль/л для того, чтобы рН довести до 6,0. Полученный раствор используют для определения активности β-амилазы.

Дата добавления: 2015-08-06 | Просмотры: 621 | Нарушение авторских прав