АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Определение аллергенспецифических IgE в РАСТ с применением флюоресцентной метки

К аллергену, сорбированному на целлюлозном носителе, добавляют сыворотку крови пациента. Затем добавляются меченные ферментом
(β-галактозидазой) анти-IgE-АТ, которые связываются с образовавшимся конъюгатом. После отмывания несвязавшихся антител добавляют
субстрат (4-метилимбеллиферил-β-D-галактозид), в случае ферментации которого образуются флуоресцентные вещества, концентрация которых выявляется при помощи ридера (FluoroCount).

В качестве примера метода,основанного на эффекте хемилюминесценции, можно привести МАСТ.

MACT (множественный аллергосорбентный тест) — метод определения аллергенспецифических IgE, аналогичный по принципу постановки РАСТ, где аллерген сорбирован на целлюлозных нитях, а в качестве индикатора реакции используются фотореагенты, свечение которых регистрируется на пленке Polaroid, на люминометре, на фотометре
(рис. 8). Метод позволяет быстрее получить результаты исследования,
дает возможность определять необходимые параметры даже у одного больного, не ожидая накопления проб для использования целого набора.

Рис. 8. Устройство для постановки МАСТ:

1 — MAST-панель в сборе; 2 — крышка; 3 — целлюлозные нити с адсорбированным аллергеном; 4 — корпус

Псевдоиммуноблот — метод, позволяющий одновременно выявлять специфические IgE-антитела к спектру аллергенов (к каждому из них)
в сыворотке или другом материале. Псевдоиммуноблот основан на твердофазном ИФА, но в отличие от последнего обладает большей специфичностью (но меньшей чувствительностью), быстротой выполнения, минимальным объемом крови (менее 0,5 мл), возможностью одновременного тестирования с большим числом аллергенов (около 20 в каждой панели). Кроме того, сейчас применяется программная высокоточная обработка результатов.

Современные тест-системы построены по принципу двухуровневого определения аллергостатуса: на первом уровне производится стандартное аллергообследование, позволяющее определить группу аллергенов,
к которой имеется чувствительность. После этого возможно проведение расширенного (более точного и сложного) определения чувствительности к конкретному аллергену.

Классический иммуноблот применяют в случае наличия четких указаний на причинный аллерген (данные анамнеза, элиминационного теста и др.) и отрицательных результатов тестирования на специфический IgE с охарактеризованными компонентами этого аллергена. В таких случаях из грубого экстракта аллергена получают блоты и проводят анализ сыворотки больного на наличие IgE, специфичных к минорным (не охарактеризованным) компонентам аллергена.

Микроэррей (microarrey) является сравнительно новым (разработан
в 1990-х гг.) и весьма перспективным направлением в прикладной молекулярной биологии. В настоящее время наибольшее распространение
получила технология микроэррея, основанная на ДНК-олигонуклеотидах, однако развивается и микроэррей с применением моноклональных антител и рекомбинантных антигенов. В частности, подобная технология
применяется для диагностики и оптимизации лечения аллергий (рис. 9).

Рис. 9. Схема проведения микроэррея для диагностики аллергии

Исследование проводится в несколько этапов:

1. Приготовление микрочипа: рекомбинантные аллергены раскапываются на поверхность активированного предметного стекла (объем
капли — нанолитры, количество антигена — десятки пикограмм). Одно стекло содержит 12 ячеек. Каждая ячейка содержит десятки (сотни) различных аллергенов и калибровочную кривую (возрастающие количества IgE) в триплетах. Таким образом, одновременно можно обследовать до
12 пациентов.

2–3. Ход теста:

а) раскапывание сывороток пациентов (15 мкл);

б) инкубация (IgE пациента соединяются с аллергенами);

в) добавление моноклональных антител против IgE, меченных флуорохромом;

г) сканирование микрочипа;

д) типичная сканограмма микрочипа:

– первые три ряда = калибровочная кривая (интенсивность свечения пропорциональна количеству фиксированных IgE);

– далее — профиль сенсибилизации пациента (специфичность и количество IgE в сыворотке пациента).

Тесты активации клеток аллергенами (CAST) являются современными методами диагностики ГНТ медиаторного типа, не обусловленной IgE (рис. 10).

Рис. 10. Принцип постановки CAST/FAST:

1 — стимуляция базофилов (IgE-зависимая, с помощью аллергена; с помощью анти-FceRI-антител; IgE-независимая, с помощью пищевых добавок, нестероидных противовоспалительных средств (аспирин), лекарственных препаратов); 2 — идентификация базофилов. Проводится только для FAST, обычно с помощью меченых антител против IgE или рецепторов к хемокинам CCR3; 3 — учет реакции. CAST учитывают
с помощью количественного определения лейкотриенов (тИФА). FAST — путем определения процента активированных базофилов (экспрессирующих CD63) с помощью цитофлуориметрии

Ранее подобную реактивность выявляли в тестах повреждения лейкоцитов и стимуляции выделения гистамина базофилами, однако они слишком трудоемки, плохо воспроизводятся и не поддаются стандартизации. СAST/FAST ставится в несколько стадий:

1. Выделение лейкоцитов крови:

а) к стабилизированной крови добавляют декстран для осаждения эритроцитов;

б) надосадок центрифугируют для осаждения лейкоцитов (удаление декстрана и тромбоцитов);

в) осадок лейкоцитов ресуспендируют в буферном растворе, содержащем ИЛ3.

2. Стимуляция лейкоцитов:

а) с анти-FceRI-антителами (положительный контроль);

б) физиологическим раствором (отрицательный контроль);

в) аллергеном(ами) в различных концентрациях.

3. Супернатанты отбирают и немедленно определяют содержание лейкотриенов с помощью твердофазного ИФА. Для количественного
определения необходимо использовать несколько разведений стандартов для построения калибровочной кривой.

4. Интерпретация теста. Для пищевых аллергенов нижний (пороговый) уровень (cut off) обычно равен 400 пг/мл; для пищевых добавок,
лекарственных аллергенов, аэроаллергенов — около 40 пг/мл.

FAST отличается от CAST способом учета активированных базофилов: обнаружение и подсчет процента клеток, экспрессирующих CD63
и связанные IgE (рис. 11). Интересующие нас клетки должны иметь связанные на поверхности IgE, т. е. связывать анти-IgE-антитела, меченные FITC, и сильно светиться зеленым. Активированные тучные клетки,
помимо этого, экспрессируют CD63, связывают анти-CD63-антитела,
меченные РЕ, и светятся красным. Таким образом, тест положительный, если значительный (>5–15 %) процент клеток (точки на графике) обнаруживается во втором квадранте. В настоящее время существуют коммерческие наборы для постановки комбинированных тестов (CAST и FAST
в одной пробирке).

Следует отметить, что CAST/FAST выявляет выделение лейкотриенов лейкоцитами как в связи, так и без наличия аллерген-специфических IgE. Основные показания для применения CAST/FAST: подозрение на ГНТ по медиаторному типу и отсутствие специфических IgE; наличие гиперчувствительности к пищевым добавкам и лекарственным аллергенам; диагностика аспириновой астмы и подобных состояний. CAST/FAST не рекомендуются как тесты для первичного аллергологического обследования (они сложнее, дороже и уступают стандартным тестам обнаружения специфических IgE (UniCAP и т. д.)).

а б