 |
|
АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология |
Лабораторные работы. Лабораторная работа № 1. Определение активности АСТ (аспартатаминотрансферазы) в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
Лабораторная работа № 1. Определение активности АСТ (аспартатаминотрансферазы) в сыворотке крови по Райтману и Френкелю
Принцип метода. В результате переаминирования, происходящего под действием АСТ, образуется щавелевоуксусная кислота. Щавелевоуксусная кислота спонтанно декарбоксилируется в пировиноградную. При добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной среде образуется гидразон пировиноградной кислоты красно-коричневого цвета, интенсивность окраски которого определяется колориметрически (см. уравнение). Ход работы. Пробирку с 0,25 мл субстратно-буферной смеси нагревают в термостате при 37 °C в течение 5 мин, добавляют 0,05 мл сыворотки крови и инкубируют 60 мин в термостате при этой же температуре. Добавляют 0,25 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют еще 2,5 мл NaOH, перемешивают и оставляют еще на 10 мин при комнатной температуре. Измеряют на фотометре экстинкцию опытной пробы при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве контрольной пробы используется дистиллированная вода. Расчет. Производят по калибровочному графику. Норма. АСТ – 0,1–0,45 ммоль/ч.л (пирувата на 1 л сыворотки крови за 1 час инкубации при 37 °С). Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
Лабораторная работа № 2. Определение активности АЛТ (аланинаминотрансферазы) в сыворотке и плазме крови ферментативным методом (УФ-области)
Принцип метода. Основан на сопряжении двух ферментативных реакций (АЛТ и ЛДГ) – трансаминирования и последующего NADH-зависимого восстановлении пирувата, образующегося в процессе трансаминирования. I этап: АЛТ L-ала + a-кетоглутарат ¾® пируват + L-глу;
II этап: ЛДГ пируват + NADH+H+ ¾¾¾¾® L-лактат + NAD+.
Ход реакции регистрируют по убыли восстановленной формы кофермента – NADH+Н+, имеющего максимум поглощения при 340 нм. Ход работы. Активность АЛТ в сыворотке крови определяют в 2 этапа. I этап. В пробирку вносят 1 мл раствора № 1 (смесь ЛДГ, NADH+Н+ буфер-субстрата, пиридоксаль-фосфата) и 0,1 мл сыворотки крови, перемешивают и термостатируют 5 мин при 37 °C. II этап. Содержимое пробирки переливают в кювету, предварительно нагретую до 37 °C, и добавляют 0,1 мл раствора № 2 (a-кетоглутарат). Измеряют оптическую плотность при длине волны 340 нм, ширине кюветы 10 мм, в интервале 3 мин. Расчет. Вычисляют изменение экстинкции за 1 мин (DА/Dt) в мккат/л, а также каталитическую концентрацию (активность АЛТ) по формуле С = D A/ D t ´ 31,75. Норма. Активность АЛТ сыворотки крови равна 0,15–0,96 мккат/л. Клинико-диагностическое значение. Определение активности АЛТ и АСТ широко используется в ранней дифференциальной диагностике различных заболеваний. Оба фермента высокоактивны в различных тканях. Однако наибольшая активность АЛТ приходится на печень, а АСТ – на миокард. В связи с высокой информативностью определение активности АЛТ используется для ранней диагностики болезни Боткина (до появления желтухи и первых симптомов болезни – недомогания, слабости и т. д.), а также ее безжелтушных форм. Высокая активность фермента в крови поддерживается первые 10–15 дней, а затем постепенно снижается. Степень увеличения активности АЛТ коррелирует с тяжестью болезни. АСТ более специфична для миокарда, поэтому используется для ранней дифференциальной диагностики инфаркта миокарда. Причем увеличение активности отмечается через 24–36 часов и снижается на 3–7-е сутки. Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагностическую оценку.
Рекомендуемая литература Основная 1 Материал лекций. 2 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 354–364; 1998. С. 451–468. 3 Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 323–327, 331–338. Дополительная 4 Марри Р. и др. Биохимия человека. М.: Мир, 1993. Т. 1 С. 343–355. 5 Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. С. 259–267. 6 Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 2. С. 653–681. 7 Врожденные и приобретенные энзимопатии / Под ред. Т. Ташева. М.: Медицина, 1980. С. 120–136. 8 Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М.: Медицина, 1981. С. 574–586.
Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 805 | Нарушение авторских прав |
