АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Список літератури

6. Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с англ. /Под ред. Д. Кэтти. – М.: Мир, 1991. – 287 с.

7. Антитела. Методы: Кн. 2: Пер. с англ. /Под ред. Д. Кэтти. – М.: Мир, 1991. – 384 с.

8. Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений. - М.: Мир, 1978. – 429 с.

9. Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовирусологии. – М: Наука, 1985. – 183с.

10. Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. – М: Наука, 1993. – 301 с.

11. Гнутова Р.В. Вирусология с основами иммунохимии. – Владивосток: Дальнаука, 1999. – 163с.

12. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. /Под ред. Т.В. Перадзе, П. Халомена. – М. – 1985.

13. Иммуноферментный анализ. /Под ред. Т.Нго, Г. Ленхоффа. М.: Мир, 1988.

14. Меклер Л.Б. Методы вирусологии и молекулярной биологии. - М.: Мир, 1972. – 444 с.

15. Метьюз Р. Вирусы растений. – М.: Мир, 1973. – 600 с.

16. Практикум із загальної вірусології. /За ред. А.Л. Бойка. – К.: Видавничий центр «Київський університет», 2000. – 269 с.

17. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. – М.: Мир, 2000. – 582 с.

18. Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. – М.: Колос, 2000. – 272 с.

19. Bernard R. Glick and Jack J. Pasternak. Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA. – 1998. - ASM Press, Washington. – 683 p.

20. -Flint S. J., Enquist L.W., Krug R.M., Racaniello V.R., Skalka A.M. Principles of Virology: Molecular biology, Pathogenesis, and Control. – 2000. – ASM Press, Washington. – 804 p.

21. Hadidi A., Khetarpal R.K., Koganezawa H. Plant Virus Disease Control.- 1998. - ASM Press, Minnesota. – 683 p.

Тема 2. Застосування полімеразної ланцюгової реакції у вірусологчних дослідженнях

Зміст

Вступ

Обладнання для ПЛР

Компоненти реакції

Параметри температурних циклів

Аналіз ПЛР-ампліфікованої ДНК

Real-time PCR (ПРЛ у реальному часі) та її застосування у вірусологічних дослідженнях

Контрольні запитання

Література

Вступ

Одним з важливих завдань, що стоять перед сучасною вірусологічною наукою, є своєчасне виявлення та ідентифікація вірусів – збудників інфекційних захворювань. В останній час все більше розповсюдження одержують найновіші методи діагностики, які базуються на виявленні в досліджуваних клінічних та рослинних зразках специфічних послідовностей вірусного геному. Найбільшого розповсюдження набула полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) (PCR- polymerase chain reaction).

Більш ніж за 20 років, які пройшли з часу відкриття ПЛР (1983 рік, Кері Мюлліс, Cetus, California) ПЛР знайшла застосування в усіх галузях біології, опубліковано тисячі робіт, в яких використовувалася ця реакція.

ПЛР значно полегшила роботу молекулярних біологів, вірусологів – з її допомогою можливе отримання якої завгодно кількості фрагментів специфічної ДНК.

Зараз жодне молекулярно-біологічне дослідження генів, в тому числі і вірусних, не обходиться без іі застосування. ПЛР використовується не тільки для детекції аномальних генів та вірусів, але і для фундаментальних досліджень в області молекулярної біології. Завдяки ПЛР стало можливим досліджувати віруси, вбудовані в геном клітини-господаря, а також віроіди та вірусоіди. ПЛР дає можливість протягом дня з одієї молекули ДНК отримати 100 млрд. подібних по структурі молекул. Ця реакція дуже проста у виконанні, необхідні лише пробірка, декілька відносно простих реагентів, джерело тепла та охолодження. Препарат ДНК, якій необхідно копіювати, може бути очищеним, а може представляти собою складну суміш біологічних речовин. Як джерело ДНК підходить і біоптат з тканини пацієнта, і тотальна НК з рослин, і одна волосина, і крапля крові, знайдена на місці злочину, і мозок мумії і навіть тіло мамонта, який пролежав 40 000 років у вічній мерзлоті.

Застосування молекулярних методів для діагностики ДНК обмежується їх невисокою чутливістю та часом, який необхідний для аналізу. Так, для визначення нукелїнової кислоти-мішені методом гібридизації in situ з застосуванням радіактивно міченого зонду необхідно, щоб мішень була присутня в препараті в кількості декількох тисяч копій. Нерідко число аномальних (або вірусних) послідовностей в клінічному препараті діагностично значиме, але менше цієї величини, тоді гібридизація може дати псевдонегативний результат. На відміну від цього ПЛР виявляє унікальну нуклеотидну послідовність навіть в одній копії ДНК. На табл.6.1 приведені дані, які дозволяють порівняти метод ПЛР з іншими молекулярно-біологічними методами досліджень.

Таблиця 6.1.

Прівняння ПЛР з іншими молекулярно-біологічними методами.

*1 копія на 100 000 клітин

Труднощі, з якими стикаються дослідники при дослідженні ДНК, обумовлені самою її природою.

З курсу загальної біохімії та біохімії вірусів відомо, що ДНК - це "тендітні" ланцюги, які побудовані з 4-х типів дезоксирибонуклеотидів: дезоксіаденінтрифосфата (А-аденін), дезоксітимидінтрифосфата (Т-тимин), дезоксігуанінтрифосфата (Г-гуанін), дезоксіцитиднтрифосфата (Ц-цитозин). В послідовності цих основ закодована генетична інформація – триплет нуклеотидів кодує одну амінокислоту. Одиночні ланцюги ДНК зустрічаються рідко, звичайно пари ланцюгів з комплементарними послідовностями утворюють подвійні спиралі, в яких залишки А зв’язані з залишками Т, а залишки Г з залишками Ц (Рис.6.8).Кожний ланцюг складається з цукро-фосфатного остова, вздовж якого перпендикулярно довгій осі подвійної спиралі розташовані основи, які зв’язані водневими зв’язками. Кінці ДНК хімічно відрізняються, один підписують як 5’ (залишок фосфорної кислоти), другий 3’ (цукор). В подвійній спіралі ДНК комплементарні ланцюги антипаралельні, як наслідок, 3’ кінець одного ланцюга зв’язаний з 5’ кінцем іншого.

Рис.6.8. Схематичне зображення молекули ДНК

В клітинах молекули ДНК оточені білками, які забезпечують її більш щільне скручування. Як правило, не вдається виділити ДНК непошкодженою – нитка частіше всього розірвана в випадкових місцях, а це дуже обтяжує подальші дослідження.

В нормальних умовах ДНК являє собою складно побудовану молекулу з 4-мірною структурою. В клітині реплікація вібдувається завдяки ферменту ДНК-полімеразі (рис. 6.9). Вивчені молекули ДНК-полімераз, які виділені з різних вірусів. Вони незначно різняться своєю будовою, але активні центри в них побудовані однаково.

Рис.6.9. Схема добудови подвійного ланцюга ДНК за допомогою ферменту ДНК-полімерази.

ДНК-полімерази були відкриті в 1955 році Корнбергом зі Станфордського ун-ту, США. ДНК-полімераза виконує ряд функцій, в тому числі забезпечує репарацію та реплікацію ДНК. Ці ферменти здатні подовжувати короткі олігонуклеотидні затравки, приєднуючи до 3’ кінця наступний нуклеотид, але для цього необхідно, щоби затравки були гібридизовані (зв’язані) з комплементарним ланцюгом ДНК, який називається матрицею. Розчин, в якому відбувається ця реакція, повинен містити нуклеозидтрифосфати (вони використовуються як будівельні блоки). Нуклеотид, який приєднує ДНК-полімераза, комплементарний основі у відповідному положенні матричного ланцюга. Наприклад, якщо це А, полімераза приєднує Т, якщо матричний нуклеотид Г, то фермент приєднує Ц. Багаторазово повторюючи цю реакцію, полімераза може подовжувати 3’кінець праймера, поки не дійде 5’ кінця матриці. В ході репарації та реплікації кожен ланцюг виступає матрицею для синтезу іншого.

Для розуміння механізмів ПЛР необхідно відмітити таку властивість ДНК, яка є основою ПЛР – це можливість ДНК денатуруватися (при плавленні) та ренатуруватися (при відпалюванні). Тобто при нагріванні дволанцюнові молекули ДНК розплітаються та утворюються 2 окремі ланцюги, а при охолодженні відбувається їх ренатурація – знову з’єднуються 2 ланцюги за принципом комплементарності (Рис. 6.10).

Рис. 6.10. Крива плавлення ДНК бактеріофагу Сд (ДНК бактеріофагу Сд в 0,15М NaCl + 0,015M трицитрат Na (рН 7,0).

При денатурації ДНК in vitro, якщо в суміші присутні олігонуклеотидні мішені (які зазвичай менші за матричну ДНК, тому більш мобільні і скоріше будуть приєднуватися до олДНК) буде відбуватися їх комплементарне з’єднання з матричною ДНК, а ДНК-полімераза миттєво починає синтез (добудову) ланцюга на вільному 3’ кінці.

В 70-роках вчені почали вивчати молекули ДНК за допомогою олігонуклеотидних зондів. Олігонуклеотид – це коротка ділянка нуклеотидів, розташованих в специфічній послідовності. У визначених умовах олігонуклеотид специфічно з’єднується з комплементарною послідовністю нуклеотидів на олДНК. Тому штучно синтезовані радіоактивні олігонуклеотиди можуть слугувати зондами для визначення присутності специфічної послідовності нуклеотидів (радіоізотопний метод). З 1983 року синтез олігонуклеотидів (праймерів) став легким та доступним завдяки автоматичним синтезаторам, які присутні зараз в усіх великих молекулярно-біологічних центрах.

Олігонуклеотидні праймери виконують 2 функції:

З одного боку, вони комплементарні визначеній ділянці ДНК, за іх допомогою можливо знайти специфічну ділянку на молекулі, до якої вони приєднаються за принципом комплементарності, а з другого - вони виступають затравками для початку виконання своїх обов’язків ДНК-полімеразою – добудови ділянки ДНК (що вона успішно робить, використовуючи для цього вільні нуклеотиди).

Зараз найчастіше використовується термостабільна ДНК-полімераза, яка попередньо була виділена з бактерії Thermus aguaticus (Tag). Ця бактерія була виділена з гарячих джерел і витримувала температури до 98С. Полімераза, яку використовували в перших експериментах (фрагмент Кленова ДНК-полімерази І E. coli), легко інактивувалася при нагріванні, тому її потрібно було додавати після кожного циклу (раунду реплікації). Полімераза Tag стабільна і активна при високих температурах, тому можливе її додавання один раз на початку ампліфікації. Ще одна перевага Tag полімерази – більш високий оптимум температурного режиму детермінуємої реакції (добудова відбувається при 70-75С), що значно підвищує специфічність, кількісний вихід та можливу довжину синтезованих копій.

Таким чином, до 1983 року були виведені усі посилання для успішного синтезу великої кількості специфічних ділянок ДНК. Для першого досліду з застосуванням ПЛР Кері Міллісом була вибрана ділянка плазмідної ДНК довжиною 25 нуклеотидів та праймери 11 та 13 нуклеотидів. Цей дослід довів, що ампліфікація ділянки ДНК можлива.

Для проведення ПЛР використовують в надлишку олігонуклеотидні праймери, досліджувану ДНК, при цьому утворюється комплекс, та проводять ампліфікацію in vitro. Оскільки праймери гібридизуються з обома ланцюгами ДНК, то і нативна послідовність і синтезовані ПЛР-продукти можуть виступати матрицями для подальших раундів реплікації, в результаті чого число копій унікальної послідовності експоненційно збільшуються (приблизно за формулою 2^n, де n число раундів реплікації, які відбулися). Завдяки цьому послідовності, які присутні в досліджуваному матеріалі в мінімальній кількості (одна чи декілька копій) та не виявляються ніякими іншими методами, легко виявляються за допомогою ПЛР. Якщо говорити образно, ПЛР дозволяє знайти "голку в скирді сіна" – всього одну послідовність ДНК, яка присутня в досліджуваному зразку (Рис. 6.11.).

Рис. 6.11. Експоненційне збільшення ділянок ДНК, які утворюються за допомогою ПЛР.

Експоненційне збільшення числа копій послідовності-мішені не тільки забезпечує високу чутливість методу, але й полегшує її виявлення.

Процес ампліфікації складається з повторюючихся циклів температурної денатурації ДНК, відпалу праймерів з комплементарними послідовностями та послідуючою добудовою полінуклеотидних ланцюгів за допомогою ДНК-полімерази. Праймери орієнтовані таким чином, що синтез за допомогою полімерази вібдувається тільки між ними, подвоюючи кількість копій цієї ділянки ДНК (рис. 6.12).

Рис. 6.12. Процес проведення ПЛР (перші декілька циклів ампліфікації).

Після декількох циклів нарощування праймерів, відділення продуктів полімеризації, зв’язування нових праймерів та їх нарощування, довжина ланцюгів ДНК що експоненційно збільшуються (накопичуються) є фіксованою, тому, що їх кінці будуть чітко визначатися 5’кінцями олігонуклеотидних праймерів. Якщо синтезувати праймери, які зв’язуються з більш відділеними одна від одної ділянками, можливо реплікувати молекули більшої довжини.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 685 | Нарушение авторских прав