АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Імуноферментний аналіз

Початком використання імуноферментних методик у вірусологічних дослідженнях вважають появу перших повідомлень про можливість приєднання ферментів до білків, в тому числі і до імуноглобулінів. Зусилля дослідників зконцентрувались на розробці методів кількісного імунохімічного аналізу, заснованого на використанні антигенів (Аг) та антитіл (Ат), мічених ферментами. На початку 1970-х років був запропонований метод, який поєднує ферментативний та імунохімічний підходи, що призвело до створення імуноферментного аналізу (ІФА), в якому антитіло виступає як специфічний детектор речовини, що визначається, а фермент – як маркер імунохімічної реакції, з допомогою якого візуалізується утворення комплексів.

Методи ІФА розділяються на дві великі групи: твердофазний і гомогенний аналіз. В світовій літературі перший скорочено позначають “ELISA” (від англ. e nzyme-linked immunosorbent assay, що означає дослівно “ферментзв’язаний імуносорбентний аналіз”). В цьому методі використовується принцип імобілізації одного із компонентів (антигену або антитіла) на носії. Гомогенні методи аналізу (“ЕМІ”, enzyme multiplay immunotechnic) були розроблені для визначення низькомолекулярних сполук – гаптенів, гормонів, фізіологічно активних сполук. Суть цих методів заключається в тому, що гаптен пришивається ковалентно поблизу активного центру ферменту таким чином, що після його взаємодії з антитілом молекула ферменту втрачає свою каталітичну активність. Додавання в цю систему вільного гаптену призводить до пропорційного збільшення активності ферменту в результаті витіснення антитіл з комплексу. Як ферменти в таких системах використовують лізоцим, малатдегідрогеназу та ін. Це високочутливий тест, який дозволяє виявляти білки, що містяться в кількості декількох нанограм в 1 мл.

Широко ввійшов в практику ІФА – метод фізичної адсорбції антигенів та антитіл на поверхні мікроплат із непористого полістирола. Аналіз проводиться в 5 основних етапів: 1) фізична сорбція антитіл (або антигену) на твердофазний носій; 2) імунологічна реакція: внесення антигену (або антитіл) в ті ж лунки; 3) імунологічна реакція (друге специфічне зв’язування): внесення комплексу кон’югат-фермент, хімічним шляхом зв’язаного з антитілами; 4) ензиматична реакція, коли фермент, діючи на субстрат, сприяє появі забарвленого комплексу; інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену (або антитіла) в лунках; 5) врахування результатів з допомогою приладів – абсорбціометрів, які дозволяють вимірювати оптичну густину продукту ферментативної реакції безпосередньо в лунках імунологічного планшету (рис. 6.6). Таким чином, весь процес ІФА можна умовно розділити на три основні стадії: формування специфічного комплексу антиген-антитіло, введення в нього мітки (імунохімічний процес) і її візуалізація тим чи іншим фізичним способом. Перед постановкою ІФА проводиться робота, яка включає слідуючі етапи: вирощування біологічно чистого матеріалу з моноінфекцією, отримання очищенних вірусних препаратів, приготування антисироваток з високим титром специфічних антитіл, виділення IgG і кон’югування з ферментами.

Рис. 6.6. Основні етапи ІФА.

Кількість адсорбованої речовини на полістиролі залежить від багатьох факторів (температури, рН, іонної сили, часу інкубації, присутності в суміші інших компонентів) і змінюється при їх варіюванні. Зв’язування білку з носієм залежить і від його концентрації, причому сумісний вплив рН та іонної сили найбільш чітко проявляється при більш високих концентраціях білку в розчинах. Зв’язування з полістироловим носієм безпосередньо залежить від часу і температури обробки. Обробка мікроплат яким-небуть інертним білком, наприклад альбуміном або желатином, після їх насичення антитілами дозволяє заблокувати залишкові вільні центри зв’язування, з якими могли б неспецифічно взаємодіяти молекули кон’югату.

Після з’єднання антигену або антитіла з твердим носієм можна проводити реакцію прямого, непрямого, конкурентного і сендвіч-типу (рис. 6.7).

а б

в г

Рис. 6.7. Схематичне зображення різних модифікацій ІФА:

а – прямий ІФА;

б – непрямий ІФА;

в – ІФА в модифікації DAS;

г – ІФА в модифікації TAS.

При прямому варіанті ІФА лунки мікроплат покривають тестуючим антигеном, інкубують, потім надлишок антигену видаляють і додають вірусспецифічне антитіло, кон’юговане з ферментом. Після інкубації надлишок кон’югату видаляють і додають субстрат (хромоген). Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості антигену. Метод потребує мінімальної кількості операцій, незначної витрати реагентів і легко може бути автоматизований.

При непрямому варіанті ферментну мітку вводять не в антивірусні імуноглобуліни, а в антитіла до них. Імунний комплекс Аг-Ат, імобілізований на твердому носії інкубують з антивидовими антитілами, які мають ферментну мітку Ат₂-Ф. Головна перевага методу – простота підготовки реагентів. Виключається складна процедура підготовки сироватки – очистка, виділення IgG і зв’язування їх з ферментом; можливе використання неочищенного вірусного препарату.

При використанні сендвіч-методу або його модифікації на тверду підкладку послідовно сорбують первинні антитіла, досліджуваний антиген і вторинні антитіла. У випадку простого варіанту сендвіч-методу ферментна мітка вводиться до складу вторинних антитіл, а при модифікованому методі – вторинні антитіла проявляються комплементарними до них антивидовими ензим-міченими (ЕМ) імуноглобулінами (кон’югатом). Сендвіч-метод з використанням поліклональних антитіл проводять в три стадії інкубації і декілька стадій відмивки. Однак, при використанні моноклональних антитіл, специфічних до різноманітних ділянок антигену, число стадій інкубації та промивання можна скоротити. Останнім часом ця модифікація знаходить все більш широке використання, так як для постановки реакції немає необхідності отримувати специфічні для кожного конкрентного випадку ЕМ антитіла.

Серед методів ІФА можна виділити два типи – це так званий послідовний, або неконкурентний, та конкурентний аналіз.

При конкурентному гетерогенному аналізі присутні в реакційному середовищі зв’язані і не зв’язані з ферментом антигени одночасно вступають в конкурентну взаємодію з імобілізованими на твердому носії антитілами. При інкубації надлишок незв’язанних компонентів відмивають і в систему додають відповідний субстрат.

ІФА дуже зручний, оскільки антигеном у фітовірусології в імуносорбентному тесті може бути свіжий сік рослин, очищені вірусні препарати, гомогенат із насіння або з комах-переносників.

Одна з важливих переваг ІФА – висока чутливість, яка досягається, як правило, за рахунок ферментного кон’югату, збільшення періоду інкубації, особливо на стадії ферментативної реакції, і здійснення такої послідовності етапів, при якій антиген зв’язується з імобілізованими на носії антитілами, а потім взаємодіє з доданими на останній стадії кон’югованими антитілами. Слід відмітити, що збільшення часу інкубації далеко не завжди приводить до підвищення чутливості реакції. В кожному випадку необхідно перевіряти, чи відбувається при більш довготривалій інкубації подальший розвиток забарвлення або її послаблення, особливо у випадку проведення реакції при підвищенній температурі.

Чутливість імуноаналізу залежить від констант зв’язування специфічних антитіл; чим більша константа зв’язування, тим чутливіша система. За чутливість методу ІФА приймається та концентрація антигену (або розведення екстракту рослин, що аналізується), при якому величина оптичної густини продукту ферментативної реакції на 0,2 оптичні одиниці перевищує величину оптичної густини в контрольних лунках.

Постановка сендвіч-методу ІФА:

1. Наносять специфічні IgG по 100 мкл в кожну лунку, інкубують 14-18 год при 4º, 3- або 5-кратно промивають буфером з твін-20.

2. В лунки, що містять імобілізовані антитіла, додають по 100 мкл досліджуваного вірусу, розведеного в буфері з БСА (бичачий сироватковий альбумін), витримують 30-60 хв при 37º або ніч при 4º, відмивають лунки, як і в першому випадку.

3. Вносять кон’югат по 100 мкл, інкубують 60 хв при 37º, відмивають.

4. Додають субстратну суміш по 100 мкл, витримують 30-90 хв при кімнатній температурі.

5. Зупиняють реакцію за рахунок внесення відповідного STOP-реагенту.

6. Вимірюють результати спектрофотометрично при відповідній довжині хвилі.

При аналізі вірусу, що міститься в соці хворих рослин, контролем слугує сік листків здорових рослин. Також в якості контролю враховується неспецифічне зв’язування кон’югату в лунках, в яких антиген замінений на буфер-БСА.

На жаль, сендвіч-метод не дозволяє дати точну кількісну оцінку антигенної спорідненості вірусів однієї групи. Для вирішення цієї задачі використовують модифікацію імуноферментного конкурентного аналізу. Метод заснований на конкуренції між сорбованим на твердій фазі антигеном і конкурентним (спорідненим) антигеном за центри зв’язування антитіл, гомологічних сорбованому антитілу.

Постановка конкурентного варіанту ІФА:

1. В лунки вносять по 200 мкл антигену в буфері, що використовують для сорбції, інкубують суміш 18год при 4º, реагенти, які не зв’язались, тричі відмивають.

2. Послідовно вносять по 50 мкл розчину досліджуваного антигену (спорідненого або конкурентного) і 150 мкл сироватки в буфері-БСА, гомологічної сорбованому на планшеті антигену. Після інкубації при 37º 4-5 год вміст лунок промивають.

3. В лунки вносять по 200 мкл розчину антивидового кон’югату (наприклад, IgG віслюка проти IgG кролика, мічені ферментом). Вміст лунок інкубують 1-1,5 год при 37º і промивають.

4. Наносять субстрат і вимірюють ферментативну активність як в сендвіч-методі.

Аналіз проводиться в рівноважному режимі і час його проведення лімітований в основному часом досягнення рівноваги реакції антиген-антитіло. Для досягнення порогової чутливості використовують мінімальну кількість сорбованого антигену і концентрацію антитіл, що забезпечують зв’язування 50% сорбованого антигену при відсутності конкуренту.

Практична частина

Практична робота №1

Завдання: визначити титр вірусу в реакції гемаглютинації.

Матеріальне забезпечення: вірусовмісний матеріал, 1,0-1,5% завись еритроцитів, фізіологічний розчин, планшети з округлими лунками, піпетки, гумові груші, дезрозчин, маркер.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 2133 | Нарушение авторских прав