АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Імунологічні методи дослідження

Від самого початку досліджень вірусних хвороб постала актуальна проблема їх розпізнавання й діагностики, оскільки були відсутні швидкі та надійні методи. Візуальне спостереження зовнішніх симптомів широко застосовувалось, так як прояв симптомів залежить головним чином від взаємодії вірусу і організму. Але на характер прояву симптомів впливають різноманітні фактори, що ускладнює діагностику. Саме тому було розроблено методи виявлення та використання антитіл (імуноглобулінів) для розпізнавання антигенів, тобто серологічні реакції. Ці методи досліджень, засновані на виявленні антигенної специфічності вірусів, не залежать від взаємовідносин вірусу та організму. Завдяки специфічності антитіла реагують тільки з тими антигенними детермінантами вірусного білку, у відповідь на введення якого вони утворились, або з вірусами, що подібні за антигенною структурою. При контакті специфічних антитіл з антигеном між амінокислотними залишками антигензв’язуючого центру і епітопом антигену утворюються багаточисельні нековалентні зв’язки. В порівнянні з ковалентними зв’язками сили нековалентної міжмолекулярної взаємодії (водневі зв’язки, електростатичні, ван-дер-ваальсові та гідрофобні взаємодії) досить слабкі, однак при великій кількості слабких взаємодій сумарна енергія зв’язування стає значною.

Основна структурна одиниця імуноглобуліну будь-якого класу складається з двох однакових легких і двох однакових важких поліпептидних ланцюгів, що утримуються разом дисульфідними зв‘язками (Рис. 6.2). Від типу важких ланцюгів залежить приналежність молекули імуноглобуліну до того чи іншого класу і підкласу. Так у людини чотири підкласи IgG (IgG 1, IgG 2, IgG 3 та IgG 4). Відомі також два підкласи IgА (IgА 1 та IgА 2), але підкласів IgМ, IgD та IgЕ людини не виявлено.

Рис. 6.2. Структура імуноглобуліну класу G:

Fab-область - варіабельна область молекули імуноглобуліну;

Fc-область – константна область молекули імуноглобуліну.

Переваги серологічних методів – швидкість отримання результатів діагностики в поєднанні з високою специфічністю. Чутливість серологічних реакцій – це найменьша кількість вірусних часток в одиниці об’єму зразка, яку даний метод може виявити. Чутливість (кількісний показник) оцінюється на модельних об’єктах – очищенних препаратах вірусів, соці штучно заражених рослин, мазках-відбитках різних органів та деяких інших. Чутливість та специфічність імунологічних тестів – це основні критерії, за якими оцінюється доцільність їх використання. Підбір відповідного методу і вибір оптимальних умов для протікання реакції антиген-антитіло – одна з важливих задач, яку ставить перед собою спеціаліст.

В даному розділі розглядається ряд традиційних методів імунодіагностики, по використанню яких накопичений великий досвід.

Реакція гальмування (затримки) гемаглютинації (РГГА або РЗГА). Принцип реакції РГГА полягає в тому, що блокований антитілами вірус не може аглютинувати еритроцити. Переваги РГГА – специфічність, простота техніки, швидкість, він не потребує стерильності. Недоліки - реакція можлива тільки з гемаглютинуючими вірусами. Всі сироватки, досліджувані в РГГА, перед роботою прогрівають при 56 – 60⁰С протягом 30хв для видалення неспецифічних інгібіторів. Для РГГА використовують еритроцити тих видів, що і для РГА.

Постановку реакції проводять в два етапи. На першому етапі готують робочу дозу антигену (для вірусу грипу – 4ГАО), перевіряють її правильність за допомогою РГА. Ця процедура необхідна і тому, що чим нижчий титр вірусу, взятого для РГА, тим менші концентрації антитіл він виявляє. Титр в 4ГАО є найнижчим, що дозволяє отримувати достовірну гемаглютинацію, а оскільки в процесі реакції вірус ще двічі розводять, то кількість віріонів буде такою, яка є необхідною для аглютинації всіх 100% еритроцитів (1ГАО вірусу аглютинує 50% 1% зависі еритроцитів). Другий етап - готують серію розведень сироватки в однакових об’ємах в лунках планшету (від 1:10 до 1:1280). На точність виявлення титру антитіл впливає кратність розведень сироватки. До кожного розведення сироватки додають рівний об’єм вірусу в титрі 4ГАО. Суміш витримують певний час при визначеній температурі. В кожну лунку з АГ та АТ додають рівний об’єм 1% зависі еритроцитів. Отже, в пробірці змішують рівні об’єми сироватки крові та суспензії вірусу і після експозиції визначають, чи зберігся в суміші вірус шляхом додавання суспензії еритроцитів. Аглютинація еритроцитів вказує на наявність, а відсутність гемаглютинації – на відсутність вірусу в суміші. Відсутність вільного вірусу в суміші вірус+сироватка розцінюється як ознака взаємодії антитіл сироватки і вірусу. Іншими словами, якщо в сироватці є специфічні антитіла, то вірус втрачає здатність аглютинувати еритроцити і аглютинація відсутня.

Титром антитіл вважають те найбільше розведення сироватки, яке дає повну затримку гемаглютинації.

Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА). Суть реакції непрямої аглютинації в тому, що еритроцити з попередньо адсорбованими антигенами здатні аглютинуватись в присутності гомологічних сироваток (АТ). Еритроцити виконують роль носія зі специфічними детермінантами і склеювання їх відбувається в результаті взаємодії антиген-антитіло та реєструється візуально за характером утворюваного осаду (Рис. 6.3). РНГА дуже чутлива реакція, за її допомогою можна виявити 0,01 мг/мл АГ, а за специфічністю вона наближується до ІФА.

Існує дві модифікації РНГА: 1) адсорбція антигену на поверхні еритроцитів; 2) адсорбція антитіл на поверхні еритроцитів з наступною аглютинацією в присутності гомологічного вірусу.

Облік результатів проводять після осадження еритроцитів в контрольних лунках. За позитивний результат приймають аглютинацію еритроцитів (вони вільно розміщені по дну лунки); за негативний – компактне осідання еритроцитів у вигляді диска на дно лунки.

За титр антитіл в сироватці приймають найбільше її розведення, що викликає аглютинацію сенсибілізованих еритроцитів.

Реакція зв’язування комплементу (РЗК). Принцип реакціїзаключається у взаємодії між антигеном і антитілом в присутності комплементу. Індикатором на наявність чи відсутність комплементу у вільному стані в досліджувані суміші антиген-антитіло є гемолітична система, гемоліз якої не відбувається при відсутності комплементу. Якщо в даній системі антиген з’єднується з специфічним антитілом, то комплемент адсорбується цим комплексом і спостерігається затримка гемолізу. У випадку невідповідності антигену та антитіл комплемент включається в реакцію між гемолітичною сироваткою і чутливими еритроцитами, в результаті чого спостерігається гемоліз різної інтенсивності до повного лізису еритроцитів. Таким чином, відсутність лізису означає позитивну реакцію, в той час як повний гемоліз вказує на відсутність в досліджуваній сироватці антитіл до даного антигену.

Як і всі серологічні реакції, РЗК дає оптимальний результат при використанні певних співвідношень компонентів, тому перед постановкою основного досліду необхідно визначити робочі дози основних компонентів реакції, які встановлюються за фактом гемолізу в розведеннях кожного компоненту в присутності індикаторної системи.

Реакція нейтралізації (РН). Принцип реакції нейтралізації полягає в тому, що в пробірці поєднують рівні об’єми сироватки крові та суспензії вірусу і після витримки визначають, чи зберігся в суміші активний вірус. Проводять це шляхом зараження сумішю чутливої до даного вірусу живої системи (біопроба на тест-об’єктах). Відсутність дії вірусу на тест-об’єкт при позитивному контролі розцінюють як свідоцтво нейтралізації біологічної активності вірусу антитілами сироватки і, відповідно, гомологічності антитіл сироватки і антигенів вірусу. При цьому чим більше в сироватці антитіл до взятого вірусу, тим в більш високому розведенні вона ще здатна нейтралізувати певну (стандартну) дозу вірусу. У випадку позитивної біопроби рахують, що нейтралізація вірусу не відбулась, так як сироватка не містить антитіл до взятого вурусу. РН ставлять в двох варіантах: 1) змішують рівні об’єми різних розведень сироватки з постійною дозою вірусу; 2) з’єднують рівні об’єми одного й того ж розведення сироватки (або нерозведену сироватку) із зростаючими дозами вірусу.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1228 | Нарушение авторских прав