АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Real-time PCR (ПРЛ у реальному часі) та її застосування у вірусологічних дослідженнях.

ПЛР в молекулярній діагностиці широко використовується для детекції нуклеїнової кислоти з будь-яких організмів та займає найважливіше місце в інструментарії дослідницьких лабораторій. Real-time PCR (ПРЛ у реальному часі) походить зі звичайної ПЛР, використовуючи її швидкість, чутливість, повторюваність, при цьому зменшуючи ризик зовнішньої контамінації. В теперішній час використовується 5 хімічних речовин для детекції ПЛР- продуктів протягом real-time PCR. Ці речовини: ДНК зв’язуючі флюорофори, 5’ендонуклеази, суміжні лінійні та булавковидні (hairpin oligoprobes) олігопроби, флюоресціюючі амплікони, які вивчені детально.

Моніторинг акумуляції ампліконів в реальному часі став можливим завдяки міченню праймерів, проб або ампліконів з флюорогенними молекулами. Цей підхід має переваги над радіоізотопними олігопробами, які обов’язково включають радіактивне випромінення.

Швидкість Real Time PCR підвищується за рахунок зменшення часу циклів, відміни пост-ПЛР детекції та використання флуоресцентних міток і чутливих методів детекції їхнього випромінення. Редукція в розмірі ампліконів може також впливати на швидкість реакції, але зменшення розміру продукту не є необхідним для поліпшення точності ПЛР.

Недоліки вживання Real Time PCR в порівнянні з конвенційним ПЛР включають нездатність моніторингу розміру амплікону без входу в систему, несумісність деяких матриць (детекруємих ДНК) з деякими хімічними флюорогенами та високу собівартість аналізу.

Контрольні запитання.

1. З якою метою використовують ПЛР у вірусологічних дослідженнях?

2. Що можливо виявити за допомогою ПЛР?

3. Температурні режими при постановці ПЛР.

4. Основні компоненти полімеразної ланцюгової реакції.

5. Теоретичне обгрунтування можливості постановки ПЛР.

6. Модифікації ПЛР.

7. Виявлення ділянок вірусної РНК за допомогою ПЛР.

8. Чи можливо виявити за допомогою ПЛР пріони?

9. Переваги та недоліки використання ПЛР у реальному часі.

10. Порівняння ПЛР з іншими методами детекції ДНК.

Література.

1. Анализ генома. Методы. Под ред Дейвиса К.- М.:Мир.- 1990.-С. 176-191.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.- М.: Мир.-2002.-С.181-204.

3. Мюллис К.Необычайная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция// В мире науки.- №6.- 1990.-С.26-34.

4. Molecular methods for virus detection/ Ed. By Danny L. Wiedbrauk.- Academic Press.- 1995.-350p.

5. Molecular biology of plant viruses/ Ed. by C.L.Mandahar.- Kluver Academic Rublisher, USA.-281p.

ДОДАТОК 1

Словник використаних термінів

“In situ” гібридизація - гібридизація фрагменту ДНК (проба, зонд), міченого радіактивно або флюоресцентно з препаратом хромосом, які підготовані спеціально для подальшого дослідження під мікроскопом. За допомогою методу вдається визначати місцеположення ділянок, комплементарних пробі.

1 БУО (1 бляшкоутворююча одиниця) – те найбільше розведення вірусу, яке в культурі клітин здатне утворити 1 бляшку.

3’-кінцева послідовність - послідовність на 3’-кінці мРНК, яка не транслюється, наступна за термінуючим кодоном.

Абортивна вірусна інфекція – інфекція, для якої не характерне утворення інфекційних часток, або вони утворюються в значно меншій кількості, ніж при продуктивній вірусній інфекції.

Автономний тип вірусної інфекції – вірусна інфекція, при якій вірусний геном реплікується незалежно від клітинного геному.

Ад’юванти - (найчастіше ад’юванти Фрейнда) – група комплексних сумішей, які містять мінеральні олії (неповні ад’юванти) та завис клітин інактивованих мікроорганізмів (повні ад’юванти). Використовуються з метою тривалої іммобілізації вірусвмісного матеріалу у місці введення для вироблення у тварини стійкішого та специфічнішого імунітету.

Ампліфікація - утворення додаткових копій хромосомних послідовностей, що виявляються в хромосомній або позахромосомній ДНК.

Анамнез - відомості про попередній стан хворого.

Антикоагулянти – група речовин, які перешкоджають зсіданню крові.

Антисептика – хімічне та біологічне знешкодження мікроорганізмів та вірусів для запобігання ураженню.

Антисироватка – сироватка, виділена з крові імунізованої тварини, яка містить специфічні антитіла до певного вірусу (антигену).

Асептика – сукупність профілактичних заходів, спрямованих на створення безмікробних умов для запобігання ураженню.

Бактеріофаги – група вірусів здатних розмножуватись тільки в бактеріальних клітинах.

Біологічної нейтралізації реакція – встановлення інактивуючої дії сироватки на вірус, шляхом введення суміші лабораторній тварині.

Блотинг ДНК по Саузерну - процедура переносу денатурованої ДНК з агарозного гелю на нітроцелюлозний фільтр для гібридизації з комплементарними нуклеотидами. (Синонім – саузерн-блотинг).

Бляшка - результат руйнування клітин в місці взаємодії вірусної частинки (в тому числі бактеріофагу) з моношаром клітинної культури.

Вакцина – препарат, який містить інактивований вірус або його компоненти. Вакцини вводять в організми людей та тварин (тобто, проводять вакцинацію або імунізацію) для вироблення у них імунітету (нечутливості) до відповідного вірусу.

Гібридизація - процес утворення гетеродуплексів; інколи мають на увазі утворення комплементарних комплексів між ДНК та РНК.

Гнотобіоти - макроорганізми, які не містять життєздатних мікроорганізмів (вірусів) одного або декількох видів, відомих досліднику.

Гнотофори -це макроорганізми, які є носіями тільки одного виду життєздатних мікроорганізмів (моногнотофори в дибіотичній системі), двох (дігнотофори в трибіотичній системі) або декількох (полігнотофори в полібіотичній системі).

Гостра вірусна інфекція – така форма інфекції, за якої після утворення вірусного постомства клітина або гине абовидужує і не містить вірусних компонентів.

Декапітація – відрізання тварині голови.

Денатурація нуклеїнової кислоти - руйнування дволанцюгових молекул ДНК з утворенням двох комплементарних одноланцюгових полінуклеотидів.

Денатураці я- втрата нативної структури біомолекул.

Депіляція (епіляція) - видалення волосся зі шкіри тварини, коли це необхідно за умовами експерименту.

Диплоїдні клітинні лінії – клітинні лінії, в яких, у крайньому випадку, 75% клітин мають каріотип нормальних клітин вихідного типу; трансплантовані хом’ячкам не проявляють онкогенної активності.

ДНК-полімераза - фермент, що каталізує утворення дволанцюгової ДНК на основі одноланцюгової шляхом синтезу комплементарного ланцюга. Вихідний ланцюг має назву матричного.

Евтаназія - це гуманне безболісне умертвіння тварин, що вийшли з експерименту.

Емболія повітряна – один із поширених способів емболії дрібних лабораторних тварин. Полягає у введенні тварині у кровоносні судини повітря, що спричинює закупорку судин у місцях їх галуження і робить неможливим подальший рух крові судинами. В результаті це призводить до загибелі тварини протягом 1-5 хв, залежно від її розміру та об’єму введеного повітря.

Затравка - коротка послідовність (часто це РНК), що комплементарно взаємодіє з одним із ланцюгів ДНК; утворює вільний 3¢-ОН-кінець, використовуючи який ДНК-полімераза починає синтез ДНК-ланцюга.

Зв’язування комплементу реакція – встановлення взаємодії антигену з антитілом в присутності комплементу.

Зворотня транскрипція - синтез ДНК на матриці РНК; здійснюється ферментом зворотньою транскриптазою. (Синонім - РНК-залежна ДНК-полімераза, ревертаза).

Ідентифікація вірусу – встановлення таксономічного положення вірусу.

Ізоелектрична точка -це рН розчину, при якому рівноважуються позитивні та негативні заряди поверхні віріонів і вони випадають в осад.

Імунізація лабораторних тварин - введення вірусвмісного матеріалу тварині (обов’язково за певною схемою з урахуванням методу та часу введення) з метою отримання специфічної антисироватки до відповідного вірусу.

Імунність рослин - рослини не уражуються вірусом (синонім – стійкість)

Індикація вірусу – визначення наявності чи відсутності вірусу у досліджуваному матеріалі.

Інокулят – інфекційний вірусвмісний матеріал, який застосовується для ураження (інокуляції).

Інтеграційний тип вірусної інфекції – вірусна інфекція, при якій вірусний геном частково або повністю інтегрується з клітинним геномом та реплікується разом з ним.

Інфекційний титр - така мінімальна концентрація вірусу, яка ще здатна викликати позитивну реакцію (інфекційну, гемаглютинуючу, серологічну тощо) у 50% тест-об’єктів.

Канібалізм – поїдання тваринами особин свого виду, прояв внутрішньовидової конкуренції.

Карантин – сукупність адміністративних та медико-санітарних заходів, спрямованих на перешкоджання поширенню інфекційних хвороб людини, в тому числі вірусних. У вірусологічній практиці полягає в ізоляції тварин з невідомим епідеміологічним минулим або з ознаками захворювання на термін, який у два рази перевищує інкубаційний термін відповідної хвороби.

Карликовість та пригнічення росту – розмір рослини зменшуються внаслідок вкорочення міжвузлів, зменшення листків, плодів та інших частин рослини.

кДНК -одноланцюгова ДНК, синтезована in vitro шляхом зворотньої транскрипції; комплементарна РНК.

Кільцева плямистість – поява хлоротичних або некротичних круглих плям на листках, а іноді на плодах та пагонах.

Комплемент – компонент сироватки крові, який приймає участь в імунній відповіді.

Контамінація – забруднення.

Лізис – розпад клітини, викликаний руйнуванням її оболонки.

Літична інфекція – інфекція, в результаті якої відбувається лізис клітині.

Матриця - ДНК або РНК, які використовуються полімеризуючим ферментом (ДНК- або РНК- полімерази) для синтезу комплементарного ланцюга.

Модельні об’єкти (експериментальні або тест-об’єкти) - макроорганізми або культури клітин (в тому числі, мікроорганізмів), чиї властивості є достеменно відомими і постійними для представників одного виду (у випадку культури клітин – штаму, популяції або лінії). Відомі властивості модельного об’єкту дозволяють їх використовувати для детекції або дослідження особливостей патогенів невідомої природи.

Мозаїка – характеризується чергуванням зон із зеленим та світло-зеленим, жовтим забарвленням, що може зустрічатись як на листках, так і плодах.

Надчутливість рослин – рослини уражуються з утворенням місцевих некрозів, які з”являються внаслідок відмирання клітин біля точки зараження

Некроз – загибель клітин – гіперчутлива відповідь.

Олігонуклеотид - декілька нуклеозидів, з”єднаних фосфодіефірними зв”язками, короткий фрагмент полінуклеотидного ланцюгу, одержаний після розщеплення ферментами або хімічними реагентами. Олігонуклеотиди отримують також шляхом хімічного синтезу.

Оператор – ділянка ДНК, що впізнається специфічними білками-репресорами та негативно регулює транскрипцію структурних генів.

Пасаж -зараження чутливої тварини с метою отримання від неї нової популяції вірусу. Проводиться з метою підтримання інфекційності вірусу.

Пасаж сліпий – явище нездатності вірусу викликати видимі симптоми захворювання після перенесення його з типового господаря до іншого протягом першого пасажу.

Патогенез – зміни клітин, органів, тканин організму під впливом інфекції.

Первинна культура клітин – культура, яка походить від клітин та органів, взятих безпосередньо з організму. Культури називають первинними до початку пасування чи субкультивування.

Переживаючі клітинні культури - органні культури; проліферація яких в умовах in vitro досить обмежена або відсутня.

Підтримуючи поживні середовища - середовища, що забезпечують життєдіяльність клітин, але не їх розмноження.

Плавлення ДНК - втрата двоспіральної структури ДНК під дією температури.

Помірні бактеріофаги – бактеріофаги здатні лізогенізувати клітину та у вигляді профагу знаходитись в середині бактеріальної хромосоми або в стані плазміди.

Постійна (безперервна, перещеплювана) клітинна лінія – клітини одного типу, що здатні субкультивуватися поза організмом протягом необмеженого числа пасажів.

Праймер - оліго- або полінуклеотид, 3¢кінцева ланка якого використовується ДНК- полімеразою як затравка для приєднання наступної ланки при синтезі ДНК.

Праймери - штучно синтезовані олігонуклеотиди.

Прижиттєвий патологічний матеріал – патологічний матеріал, одержаний від живої тварини (протягом експерименту).

Продуктивна вірусна інфекція – інфекція, що завершується утворенням інфекційного потомства.

Промотор – послідовність нуклеотидів ДНК, що розпізнається РНК-полімеразою як ділянка, з якої починається транскрипція.

Профаг – внутрішньоклітинний стан фага в умовах, при яких його літичні функції пригнічуються.

Репресор – білок або антисмислова РНК, що пригнічують активність генів.

Рослини-індикатори – це рослини, які дають чітку специфічну реакцію на даний вірус, що легко відрізняється від реакції цієї рослини на інший вірус.

Ростові поживні середовища – середовища, що забезпечують існування та розмноження клітин, і містять 2-10 % сироватки корві.

Ростучі клітинні культури – культури клітин, здатні розмножуватися в умовах in vitro.

Секційний патологічний матеріал - патологічний матеріал, одержаний після розтину лабораторної тварини.

Системне ураження рослин – вірус транспортується по всіх тканинах рослини і репродукуються з чітким проявом симптомів захворювання

Сіквенс - визначення послідовностей амінокислот (сіквенс білку) або нуклеотидів (сіквенс НК).

Стерильні тварини - макроорганізми, які не мають ніяких життєздатних мікроорганізмів, які можна виявити.

Титр вірусу – кількість вірусу, яке міститься в одиниці об”єму матеріалу.

Толерантність рослин – вірус транспортується по тканинам рослини, але симптоми захворювання слабо виражені або не виражені зовсім (замасковані)

Транфекція – введення в бактеріальні клітини ізольованих молекул фагової ДНК, що приводить до утворення зрілого фагового потомства.

Тропізм - здатність вірусу реплікуватися в певних типах клітин організму. Віруси, що репродукуються у нервових клітинах, називають нейротропними, у клітинах шкіри – дерматропними, в клітинах легень та дихальних шляхів – пневмотропними, в клітинах шлунково-кишкового тракту – ентеротропними. Віруси, які здатні реплікуватися в декількох типах клітин, називають політропними, а в усіх типах клітин – пантропними (класифікація вірусів людини та тварин за Хюбнером).

Хлороз – пожовтіння зелених тканин внаслідок деградації хлорофілу.

Хронічна вірусна інфекція – така форма вірусноїй інфекції, при якій клітини продовжують продукувати вірусні частки або їх компоненти протягом тривалого часу і передають цю здатність спадково.

ЦПД (цитопатична дія) – руйнування структури клітин під впливом вірусів.

ЦПД₅₀ - доза вірусу, яка викликає появу цитопатичного ефекту в 50 % заражених клітин у культурі.

Штам клітин – популяція однорідних клітин (за одним чи декількома маркерами), які зберігають специфічні властивості протягом обмеженого періоду культивування.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 1233 | Нарушение авторских прав