АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Компоненти реакції.

Для проведення ПЛР необхідні такі складові частини:

· послідовність ДНК, що досліджується;

· буфер;

· дезоксирибонуклеозидтрифосфати (dNTP);

· два праймери, специфічних у відношенні зв’язування з дослідним зразком;

· Tag-полімераза.

Послідовність ДНК, що досліджується, має бути попередньо підготована для аналізу (повинно бути проведено виділення нуклеїнової кислоти з дослідного матеріалу.)

Буферна система має забезпечити оптимальні умови для проведення реакції.

Буфер для ПЛР, при використанні Tag-полімерази, вміщує 50мМ KCl, 10mM Tris-HCl, pH 8,4, 2,5 mM MgCl2 та 100 мкг/мл желатини. При використання комерційних ферментів цей буфер надається разом з ДНК-полімеразою.

Нейтральні розчини dNTP. Краще всього використовувати ліофілізовані порошки і робити з них водні розчини. Обов’язково робити аліквоти в декількох пробірках для можливості часткового використання, зберігати їх при –20С.

Праймери (штучно синтезовані олігонуклеотиди) для ПЛР частіше мають довжину 18-25 нуклеотидів. Можливий синтез і більш довгих затравок, але вони рідко бувають необхідні. Їх можливо синтезувати за допомогою автоматичних синтезаторів ДНК. Кількості олігонуклеотидів, які отримують таким чином (0,2-1 мкмолів) достатні для проведення декількох сотен або тисяч реакцій.

Підбір праймерів – ключова ланка ПЛР, оскільки ними визначається можливість ампліфікації та виявлення необхідної послідовності. ПЛР-ампліфіковані фрагменти ДНК мають різний розмір. Він визначається сумою розмірів праймерів та відстані між їх 3’ кінцями, в більшості випадків

Їх розмір лежить в діапазоні 200-800 нуклеотидів.

Підбір праймерів - процес емпіричний, але відповідність визначеним вимогам збільшує ймовірність отримання працюючих праймерів.

Існують загальні вимоги підбору праймерів:

1. Підбирати праймери необхідно з вмістом ГЦ пар приблизно 50% та випадковим розташуванням основ. (Чим більше ГЦ пар, тим вища температура денатурації).

2. Потрібно уникати послідовностей з стійкими вторинними структурами, оскільки можлива неповна денатурація стійких ділянок. Для вивчення вторинної структури існують спеціальні комп’ютерні програми.

3. Необхідно перевіряти затравки на комплементарність одна одній – очевидно, якщо праймери комплементарно зв’язуються один з одним при відпалюванні, вони не зможуть приймати участь у ампліфікації.

Дизайн праймерів може базуватися як на нуклеотидному, так і на амінокислотному сиквенсі (вироджені праймери).

В залежності від мети експерименту потрібно або відбирати консервативні ділянки (для дослідження вірусів однієї групи), або уникати їх (для дослідження різних штамів- наприклад, якщо праймери розроблені для одного штаму з родини лютеовірусів, то вони не повинні "помічати" інші штами цієї групи, забезпечуючи при цьому ампліфікацію усіх ізолятів вивчаємого).

Для підвищення чутливості та специфічності можливо використовувати так звані "гніздові" праймери (Nested -PCR). При цьому в ролі матриці виступає ділянка ДНК, ампліфікована в першому раунді реплікації, а в другій реакції застосовуються праймери, які ампліфікують ділянку меншу за попередню і розташовану всередині попередньої. Однак такий метод непридатний для рутинної діагностики, він використовується тільки з дослідницькими цілями.

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 575 | Нарушение авторских прав