АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Радиальная иммунодиффузия по Манчини.

Принцип метода. При добавлении исследуемого образца к смеси агара с антисывороткой происходит образование комплекса АТ+АГ, при этом меняется заряд, иммунный комплекс ста­новится нерастворимым и выпадает в осадок в виде преци­питата, диаметр которого пропорционален количеству соот­ветствующего иммуноглобулина в образце.

Техника постановки РИД (при использовании гото­вых иммунодиффузионных планшет):

- выдержать готовые иммунодиффузионные планшеты при комнатной температуре 30 мин.;

- развести дистиллированной водой или физраствором ис­следуемые образцы строго по инструкции: для определе­ния IgG – в 32 раза; для IgA – в 8 раз; для IgM – в 2 раза;

- пробойником сделать углубления в агаре готовых имму- нодиффузных планшет диаметром 2 мм;

- в лунки первого ряда внести пипеточным дозатором по 5–10 мкл контрольной сыворотки с известным содержанием Ig (г/л) и стандарты в нескольких разведениях: неразведенная, разведенная 1:2; 1:4; 1:8. Например, если неразведенная стандартная сыворотка 4 г/л, разведенная 1/2 – 2 г/л, разведенная 1/4 – 1 г/л, разведенная 1/8 – 0,5 г/л. В остальные лунки внести по 5–10 мкл исследуемых образцов. Эту процедуру проделать на каждой из трех планшет (IgG, IgA, IgM);

- инкубировать планшеты при комнатной температуре 24 ч для IgA и IgG и 48 ч для IgM;

- измерить диаметр преципитатов с помощью линейки и микроскопа;

- концентрацию IgG, IgA, IgM определить по таблице, при­ложенной к набору (в которой указана концентрация Ig г/л, соответствующая диаметру преципитата);

- неполностью использованный готовый (коммерческий) планшет можно хранить при 2–8°С в течение 2 нед. после вскрытия упаковки.

При необходимости приготовления иммунодиффузионных планшет в лаборатории – приготовить 2% агар Дифко:

- взвесить 2 г агара;

- веронал-мединаловый буфер: 1,28 г мединала, 0,23 г ве­ронала, 125 мл дистиллированной воды (рН 8,36±0,04);

- внести агар в 100 мл веронал-мединалового буфера;

- растворить смесь в водяной бане при t = 80–100°С;

- охладить до комнатной температуры;

- добавить 1 мл 1% раствора мертиолята (для консерва­ции);

- разлить агар в горячем виде по 4 мл в стеклянные про­бирки. Закрыть пробирки (предохранение от высыхания) и хранить в холодильнике при t = +4°С до использования;

- в день проведения исследования развести лиофилизированную моноспецифическую антисыворотку против IgG, IgA, IgM в 1 мл физраствора. Развести стандартную сы­воротку по инструкции;

- растопить на водяной бане 4 мл 2% агара и охладить его до 48–50° С, в этой бане подогреть моноспецифические сыворотки до такой же температуры;

- подготовить рабочую смесь: 1 мл антисыворотки влить в 4 мл 2% агара (при t = 48–50°);

- осторожно перемешать, переворачивая пробирку со сме­сью;

- подготовить столик-уровень, положить на него стекло и залить три стекла подготовленной рабочей смесью. Тол­щина слоя агара – 1–2 мм;

- после охлаждения агара работа продолжается в той же последовательности, что и при работе с готовыми план­шетами.

Учет результатов анализа:

- через установленное время (24 ч для IgG и IgA и 48 ч для IgM) измерить диаметр образовавшегося преципи­тата с помощью бинокулярной лупы. При использовании го­товых планшет значения концентрации иммуноглобулинов определяются по таблице, приложенной к каждой серии планшет. При использовании планшет, приготовленных в лаборатории, количественное содержание Ig необходимо оп­ределять по калибровочной кривой, построенный на полуло­гарифмической бумаге. Для этого на оси абсцисс отклады­ваются диаметры преципитатов стандартной сыворотки, а на оси ординат концентрация иммуноглобулинов в г/л; соеди­няются нанесенные точки калибровочной кривой. При оцен­ке концентрации Ig в образцах по оси абсцисс откладывается диаметр преципитата, восстанавливается перпендикуляр до пересечения с калибровочной кривой. Точка пересечения проецируется на ось ординат и высчитывается концентрация Ig. Таким образом строится график для каждого Ig.

Контроль качества. На предварительно построенной карте Шухарта вносятся значения контрольных материалов при каждой постановке. Возможные причины ошибок при проведении РИД и меры по их устранению указаны в таблице 4.

2. Решить ситуационную задачу (оформить протокол, дать заключение)

Произвести определение иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA в сыворотках крови человека методом РИД.

Ход исследования

Построить 3 калибровочных прямых для каждого иммуноглобулина IgM, IgG, IgA. По оси Х – откладывают диаметр зоны преципитации в мм, на оси Y – значения иммуноглобулинов в мг/мл (МЕ/мл). Неразведенные стандарты моноспецифических сывороток против иммуноглобулинов человека содержат: IgM: 1,20 мг/мл (142,5 МЕ/мл), IgG: 8,62мг/мл (107,2МЕ/мл), IgA: 1,62мг/мл (142,5МЕ/мл). При этом диаметры зоны преципитации составили:

Неразведенный стандарт для IgM – 11,0 мм; для первого разведения (1:2) – 9,6мм; для второго (1:4) – 8,2 мм; для третьего (1:8) – 7,2мм.

Неразведенный стандарт для IgG – 11, 2 мм, для первого разведения (1:2) – 9,8мм; для второго 1:4) – 8, 4 мм; для третьего (1:8) – 7,4мм.

Неразведенный стандарт для IgА – 11,2 мм, для первого разведения (1:2) – 9,8мм; для второго (1:4) – 8,4 мм; для третьего (1:8) – 7,4мм.

Исследования сывороток человека показало следующее (таблица 11)

Таблица 11

Результаты определения иммуноглобулинов в сыворотках крови человека в исследуемых образцах вписывают в таблицу и сравнивают их с нормой. Дать заключение.

3. Изучить РИД в исследовании секреторных иммуноглобулинов (метод определения записать в тетрадь)

Cекреторный им­муноглобулин A (sIgA) – основной представитель Ig в секретах организма. Играет важную роль в нейтрализации бактериальных токсинов и ло­кализации вирусов, препятствует их проникновению в орга­низм. Определение slgA играет важную роль при диагности­ке неспецифических воспалительных процессов слизистой ротовой полости, легких (бронхиальная астма).

Принцип метода. В основу метода положен метод Манчини, основанный на измерении диаметра кольца преци­питата, образующегося при внесении исследуемой слюны в лунки в слое агара, в котором предварительно диспергирова­на моноспецифическая сыворотка против slgA человека. Моноспецифическая сы­воротка содержит антитела против секреторного IgA и сво­бодного секреторного компонента. Диаметр кольца преципи­тата прямо пропорционален концентрации исследуемого slgA. Содержание slgA в исследуемых пробах определяют относительно контрольного образца с известной концентра­цией секреторного иммуноглобулина А.

Получение и обработка биоматериала для исследования нестимулированной смешанной слюны:

- через 1 ч после завтрака тщательно прополоскать рот ки­пяченой водой и собирать слюну в стерильную пробирку в течение 10 мин. Измерить общий объем слюны;

- для получения пробы для исследования перенести 1 мл слюны в чистую пробирку и отцентрифугировать образец при 1500–2000 об/мин. в течение 20 мин;

- перенести пипеткой 500 мкл надосадочной жидкости в пробирку типа «эппендорф» для анализа. При невозмож­ности использования пробы в день ее получения хранить образцы при -4 – -8°С; при длительном хранении – при -20°С.

Подготовка реактивов для анализа:

1. Подготовить веронал-мединаловый буфер (ВМБ): взве­сить 1,28 г мединала, 0,23 г веронала добавить 125 мл дистиллированной воды. Измерить рН ВМБ (рН 8,36 + 0,04);

2. Подготовить 2% агар: к 2 г сухого агара добавить 100 мл ВМБ и 1 мл 0,1% раство­ра мертиолята. Греть на водяной бане до расплавления. В горячем виде агар разлить в центрифужные пробирки и хранить в холодильнике при t = -4 -8°С до использова­ния;

3. Растворить в 2 мл дистиллированной воды моноспецифи­ческую сыворотку против секреторного иммуноглобули­на А человека;

4. Растворить в 0,5 мл дистиллированной воды контрольную сыворотку с определенной концентрацией белка 2 мг/мл. Хранить до использования в холодильнике при -20°С. Если при длительном хранении образуется хлопьевидный осадок, повторно отцентрифугировать при 2000 об./мин.;

5. Подготовить рабочую смесь: 2% агар и моноспецифиче­ская антисыворотка в соотношении 2,7 мл агара и 0,3 мл антисыворотки. Смешивать их при t = 55-57°С;

6. Подготовить чистые обезжиренные предметные стекла для заливки агаром.

Техника постановки РИД:

1. Предметное стекло положить на горизонтальный стол, очертить его края стеклографом, чтобы не растекался агар, и залить стекло 3 мл рабочей смеси. Толщина слоя агара – 1–2 мм;

2. Пока на стекле застывает агар, подготовить разведение контрольного образца секреторного IgA в следующих разведениях: неразведенная 1:1, 1:2, 1:4, 1:8;

3. В застывшем агаре пробойником сделать лунки на рас­стоянии 15 мм одна от другой;

4. В первый ряд лунок внести по 2 мкл контрольного образ­ца в разведениях: неразведенная 1:1, 1:2, 1:4, 1:8;

5. В остальные лунки внести по 2 мкл исследуемых образ­цов;

6. Стекла выдержать во влажной камере 24 ч при комнатной температуре;

7. Параллельно, с соблюдением тех же правил, в лунки гото­вых иммунодиффузионных планшет для определения сы­вороточных Ig (IgA, IgM, IgG) внести пробы пациентов и контрольные разведения стандартов для сывороточных IgA₂ (титр разведения указан на флаконе). Время инкуба­ции – 24 часа.

Имеются готовые «Диагностикумы» для определения секретор-ных Ig.

Учет результатов:

1. После окончания инкубации измерить кольца преципита­тов с помощью бинокулярной лупы. Концентрацию сек­реторного и сывороточного Ig определить по калибро­вочной кривой;

2. Построить калибровочную кривую зависимости диаметра (Д) преципитата от концентрации Ig секретов. По оси абсцисс откладываются диаметры колец преципитации, а по оси ординат соответствующие им концентрации кон­трольного образца slgA.

Интерпретация результатов. Смешанная слюна содержит сывороточные белки, в частности Ig. Для диффе­ренцированного определения количества и соотношения сы­вороточного и секреторного IgA исследование проводится на двух типах антисывороток: к секреторному slgA₁ и к сыворо­точному IgA₂. Это дает возможность определить до­полнительный показатель – свободный секреторный компо­нент, который равен разнице результатов концентраций сек­реторного и сывороточного иммуноглобулина. Увеличение транссудации секреторного IgA происходит при воспали­тельных процессах слизистой ротовой полости.

У здоровых людей slgA₁ – 0,27–0,70 г/л; sIgA₂ – 0,29–0,60 г/л; slgG – до 0,6 г/л; slgM – отсутствует; sIgA₁/sIgA₂ – 0,8–1,2 усл. ед.

Контроль качества. Контрольные значе­ния концентраций секреторного иммуноглобулина, в каждой постановке на предварительно подготовленной карте Шухар­та.

4. Изучить развернутую реакцию агглютинации с сывороткой больного (зарисовать схему, оформить протокол)

Реакция агглютинации, благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, получила широкое распространение и применение в диагностике многих заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и др. При оценке реакции возникает необходимость отличить специфическую реакцию (на видовые и типовые антигены) от неспецифической (межвидовые антигены). В этом случае дифференциация основывается на использовании монодиагностикумов, скорости нарастания титра антител к специфическим антигенам. Чтобы отличить иммунный ответ на текущее заболевание от перенесенного ранее, изучают скорость нарастания титра антител, который выше при текущей инфекции, а также определяют титры классов иммуноглобулинов. Кроме того, сопоставляют результаты с бактериологическими и клиническими данными.

5. Изучить пластинчатую агглютинация (зарисовать, оформить протокол)

Пластинчатая реакция агглютинации ставится на гладкой поверхности стекла, фарфора. Поверхность пластинки должна быть тщательно обезжирена, чтобы хорошо растекалась капля сыворотки, физиологического раствора. Реакция применяется для ускоренной серологической диагностики инфекционных болезней путем обнаружения антител, например, при бруцеллезе (реакция Хеддльсона), туляремии.

Для постановки пластинчатой реакции на стекло наносят каплю цельной или слегка разведенной сыворотки, к ней добавляют каплю концентрированного антигена, в виде живой культуры, капли перемешивают петлей или легким покачиванием стекла. При положительном результате уже через несколько минут жидкость в капле просветляется, а по краям появляются хлопья склеившихся бактерий. Реакция сопровождается контролем антигена и антитела. Существуют идругие варианты постановки реакции агглютинации: капельный, микроскопический, ускоренный по Ноблю.

Непрямая агглютинация. Эта реакция агглютинации отличается высокой чувствительностью. Она положительна даже при содержании 0,1–0,01 мг антител в 1 мл. Чувствительность этой реакции может быть повышена, если увеличить массу и объем реагентов, адсорбируя их на поверхности инертных носителей. Носителями антигена или антител могут быть естествен­ные клетки: эритроциты, лейкоциты, бактериальные клетки, а также созданные искусственно: латекс, полистирол, бентонит, частицы угля. Основное требование, предъявляемое к носителям – возможность прочно соединяться с молекулами антигена или антитела и не давать спонтанной агглютинации. Различают несколько модификаций непрямой агглютинации:

6. Изучить реакцию непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА, РПГА) (зарисовать, оформить протокол)

Носителем антигена или антител вэтой реакции служат эритроциты. Нативные эритроциты животных (барана, обезьяны, морской свинки), птиц (петуха, гуся), человека 1 группы обладают способностью адсорбировать насвоей поверхности полисахаридные молекулы, в том числе полисахаридные антигены бактерий, без предварительной обработки эритроцитов. Если же эритроциты обработать танином или трипсином, то на их поверхности будут адсорбироваться белковые молекулы, в том числе антитела, белковые антигены. Так как в лабора­торных условиях обработка свежих эритроцитов представляет определенные трудности, разработана методика сенсибилизации формалинизированных эритроцитов очищенными растворимыми антигенами микробных клеток или гамма-глобулиновой фракцией иммунной сыворотки. Эти препараты получили название эритроцитарных диагностикумов. Эритроцитарные диагностикумы являются стабильными препаратами, и работа с ними упрощена. Реакция непрямой гемагглютинации используется для обнаружения антител в исследуемой сыворотке, которую разводят и разливают в лунки плексигласовой панели. Туда же добавляют равный объем соответствующего эритроцитарного диагностикума. Постановка реакции сопровождается контролями.

Учет проводят после двух часо­вой экспозиции. Если антитела соответствуют антигену, они взаимодействуют между собой, внешним проявлением будет агглютинация эритроцитов, которая выглядит в виде рыхлого осадка с фестончаты­ми краями, занимающего большую часть дна лунки – «зонтик». Если же реакция отрицательная, то осадок эритроцитов имеет вид плотного диска в центре лунки с ровными краями – «пуговка».

Кроме того, реакция непрямой гемагглютинации может быть использована для обнаружения растворимых антигенов с помощью известных антител, адсорбированых на поверхности эритроцитов.

РНГА по своей чувствительности и специфичности превосходит многие другие серологические реакции.

7. Изучить метод выявления неполных антител (записать в терадь, зарисовать схему определения неполных антител, оформить протокол)

Неполные антитела – это антитела, которые реагируют с антигеном одним активным центром, в результате видимый комплекс не образуется, реакция визуально не проявляется. Неполные антитела называют также непреципитирующими, так как они не дают реакции преципитации. Неполные антитела, в отличие от полных, более устойчивы к нагреванию, легче проникают через плаценту. Впервые они были обнаружены к резус-антигену, потом их стали находить при бактериальных и вирусных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, аллергических состояниях, гемолитической анемии.

Наибольшей интерес представляют неполные антитела к резус-антигену эритроцитов. Несовместимость крови матери и плода по резус-антигену (отсутствие у матери и наличие у плода) является причиной гемолитической болезни плода и новорожденных. Выявляют неполные антитела в реакции Кумбса. Для выявления неполных антител предложена иммунологическая диагностическая проба Кумбса (реакция Кумбса, антиглобулиновый тест). Она выявляет антитела к резус-антигену эритроцитов, бактериальным антигенам в сыворотках больных. Эти антитела появляются уже в первые дни болезни. Название пробы связано с именем английского иммунолога Кумбса, предложившего эту реакцию. Реакция Кумбса является одним из методов ранней диагностики инфекционных заболеваний.

Различают два варианта реакции Кумбса:

- прямая реакция Кумбса;

- непрямая реакция Кумбса.

Прямая реакция Кумбса. В прямой реакции Кумбса выявляют анти­тела, связанные с эритроцитами. Для этого исследуемую кровь смеши­вают с антиглобулиновой сывороткой. Антитела антиглобулиновой сыворотки взаимодействуют с неполными антителами, находящимися на поверхности эритроцитов и склеивают последние.

Положительная прямая реакция Кумбса служит основным диагностическим признаком при приобретенной аутоиммунной гемолитической анемии, гемолитической анемии новорожденных.

Непрямая реакция Кумбса. В непрямой реакции Кумбса выявляют антитела, свободно циркулирующие в сыворотке крови. Реакция про­водится в два этапа. Нa первом этапе неполные антитела адсорбиру­ют из сыворотки на нормальных эритроцитах, можно на бактериальных клетках, риккетсиях. На втором этапе эти эритроциты смешивают с антиглобулиновой сывороткой, полученной путем гипериммуниэации животных антителами человека. Молекула антиглобулина соединяет две молекулы неполных антител, фиксированных на разных эритроцитах, наступит реакция агглютинации эритроцитов, которая будет наблюдать­ся уже через 10 минут, по ней можно судить о наличии неполных анти­тел в исследуемой сыворотке.

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 3328 | Нарушение авторских прав