АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Практическая работа. 1. Изучить СD-рецепторы Т-хелперов(зарисовать)

1. Изучить СD-рецепторы Т-хелперов (зарисовать)

2. Изучить строение ТКР-лимфоцитов (зарисовать)

3. Изучить определение абсолютного количества CD4 и CD8 методом магнитного сепарирования (с использованием реактивов фирмы Dynal, Норвегия) (записать в тетрадь, оформить протокол)

Принцип метода. Выделение CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов из цельной крови основано на применении Dynabeads CD4 и Dynabeads CD8-парамагнитных полистироло­вых микрочастиц, конъюгированных с антителами к спе­цифическим клеточным маркерам CD4⁺ и CD8⁺. Использова­ние однородных по размеру и форме микросфер диаметром 4,5 мкм обеспечивает быстрое и эффективное связывание клеток, минимизирует неспецифическое связывание. Использование данной методики позволяет быстро и при минимальных затратах осуществить выделение целевых CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток. Экономичность и эффективность данной методики определяется следующим:

- исключаются стадии центрифугирования в градиенте плотности;

- выделение целевых клеток из цельной крови составляет больше 95%;

- элиминирование влияния CD4⁺-моноцитов;

- чистота выделенной фракции составляет 99%;

- высокая воспроизводимость результатов;

- коэффициент корреляции с методом проточной цитометрии более 90%;

- широкий динамический диапазон от 10 до 1500 клеток/мкл;

- время анализа – 1 ч;

- не требуется дорогостоящего оборудования;

- низкая себестоимость анализа.

Техника постановки анализа

1-й этап пробоподготовки – разбавить цельную кровь фосфатным буфером: 125 мкл крови + 350 мкл буфера.

2-й этап – удаление моноцитов:

- 25 мкл разбавленных в 2 раза Dynabeads CD 14 добавить к разбавленному образцу крови;

- инкубировать 10 мин. при перемешивании, при комнат­ной температуре;

- сепарировать 2 мин. в магните Dynal MPC-S;

- отобрать в две промаркированные пробирки супернатант, не содержащий моноциты.

3-й этап – выделение CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов:

- в соответствующие пробирки добавить по 25 мкл Dynabeads CD4 и Dynabeads CD8;

- инкубировать, перемешивая 10 мин. при комнатной тем­пературе;

- сепарировать 2 мин. в магните;

- промыть выделенные клетки в фосфатном буфере.

4-й этап – подсчет выделенных клеток на микро­скопе:

- ресуспендировать выделенные клетки в лизирующем рас­творе уксусной кислоты;

- инкубировать 5 мин. при комнатной температуре;

- добавить окрашивающий раствор генцианвиолета или акридинового оранжевого;

- подсчитать окрашенные ядра в камере Горяева на свето­вом или флуоресцентном микроскопе.

Учет результатов анализа

Подсчет окрашеных ядер производится в 20 больших квадратах (в объеме 0,4 мкл) камеры Горяева. Большой квадрат камеры Горяева – это 4 квадрата площадью 1/25 мм².

Абсолютное количество лимфоцитов субпопуляции выражается в клетках на 1 мкл цельной крови при умноже­нии числа подсчитанных ядер на фактор 7,7. Провести контроль качества метода.

4. Изучить метод определения количества CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов методом ИФА (записать в тетрадь, оформить протокол)

Принцип метода ИФА. Метод основан на специфи­ческом захвате СD4⁺ и СD8⁺ Т-лимфоцитов с помощью пара­магнитных частиц, покрытых захватывающими антителами.

Техника постановки анализа:

- вставить планшет в магнитную рамку;

- внести в соответствующие лунки стрипов стандарты, бланк и образцы крови пациентов для СД4⁺ и СД8⁺. Количе­ство вводимых растворов и схема их введения указаны в инструкции к тест-системе (на одной и той же планшете ставятся образцы СD4⁺ и СD8⁺);

- после 2-минутного интервала отсосать содержимое всех лунок в контейнер с дезраствором и дважды промыть планшет с образцами промывочным раствором;

- вынуть планшет из магнитной рамки и быстро ввести в соответствующие лунки по 100 мкл конъюгата, разведен­ного (1:10) анти-СD4⁺ и анти-СD8⁺. Накрыть планшет плен­кой;

- инкубировать 20 мин. ± 2 мин. при комнатной температу­ре;

- вставить планшет в магнитную рамку и только после это­го снять пленку;

- через 2 мин. ввести 200 мкл промывочного раствора и по­вторить промывку планшеты с образцами еще 4 раза (все­го 5 циклов промывки);

- отсосать содержимое лунок и вынуть магнитную рамку;

- быстро внести в каждую лунку по 100 мкл субстрата;

- инкубировать в темноте 20 мин. ± 2 мин. при комнатной температуре (планшет пленкой не накрывать);

- после инкубации вставить магнитную рамку, и подождав 2 мин., добавить во все лунки по 50 мкл стоп-реагента.

Учет результатов и контроль качества: измерить оптическую плотность на вертикальном фотометре

При использовании соответствующей программы можно получить количественное содержание СD4 и СD8-лимфоцитов с построением калибровочной кривой. В норме при оценке методом ИФА с использованием МкАт относительное содержание СD4: 30–60%; СD8: 15–38; абсолютное содержание клеток в мкл СD4: 600–1900; СD8: 300–800; отношение СD4/СD8 (расчетный показатель) 1,02+0,1%.

Для исключения возможных ошибок необходимо строго соблюдать следующие моменты:

- все реактивы должны быть подготовлены строго по инст­рукции;

- этапы промывки проводить строго по инструкции;

- соблюдать время инкубации и магнитного сепарирова­ния;

- использовать качественные пипеточные дозаторы;

- правильно пользоваться магнитом.

5. Подведение итогов занятия – 5 мин

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 569 | Нарушение авторских прав