АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Изучить строение антигенов HLA-второго класса (зарисовать)

(зарисовать)

4. Изучить лимфоцитотоксический тест (записать в тетрадь, оформить протокол)

Для проведения лимфоцитотоксичекского теста требуются знания параметров и нор­мативных значений клинического анализа крови, умения рассчитать количество лейкоцитов и лимфоцитов на единицу объема по общепринятым лабораторным методам.

Лимфоцитотоксический тест - иммунологиче­ская реакция, выяв-ляющая сумму всех мембранных антиге­нов Т-лимфоцитов. Среди многочисленных методов изуче­ния клеточного иммунитета наибольший интерес представ­ляет лимфоцитотоксический тест, используемый в клинике для изучения клеточной гиперчувствите-льности.

Принцип метода. Т-антитела к мембранным антиге­нам Т-лимфоцитов связываются с мембранными антигенами и в присутствии комплемента, образовавшийся комплекс – мембранно-атакующий комплекс (МАК) – на­рушает целостность клеточной мембраны. Происходит цитолиз лимфоцитов в присутствии МкАТ и комплемента. Краситель трипановый синий проникает внутрь клетки и окрашивает ее в голубой цвет. Клетки, не несущие на поверхности Т-антигены, оста­ются с неповрежденной мембраной (жизнеспособны) и не окраши-ваются красителем. Вся работа с клетками проводит­ся в стерильной посуде.

Техника постановки ЦТТ

Включает два этапа: 1) выделение популяции лимфоцитов; 2) постановка ЦТТ

1-й этап – выделение популяции лимфоцитов:

- кровь с антикоагулянтом развести в 2 раза ЗФР, осторож­но перемешать;

- осторожно наслоить по краю пробирки раствор градиента плотности 1,077–1,080 г/мл на кровь в соотношении 1:1 или 1:2;

- центрифугировать при 400 g/мин (1500 об/мин) 15–30 мин. на горизонтальном роторе (бакет-ротор);

- определить расположение слоя моноцитов;

- осторожно отобрать дозатором или стерильной пастеров­ской пипеткой белесоватое кольцо мононуклеаров (лимфоцитов) на границе градиента плотности и разведенной крови, перенести в другую пробирку;

- трижды отмыть взвесь мононуклеаров средой 199 или раствором Хенкса (по 3 мл) при центрифугировании 1000 об/10 мин;

- после центрифугирования оставить 1 мл осадка, осталь­ное (2 мл) вылить;

- плазму отобрать для оценки гуморального звена (при не­обходимости);

- добавить к выделенным клеткам цитратный гемостабилизатор в соотношении 1 часть стабилизатора и 7 частей лейкоцитарной взвеси;

- подсчитать количество выделенных клеток в камере Горяева по общепринятым лабораторным методам;

- количество клеток должно быть не менее 2 х 10⁶ мл (не менее 80%);

- определить жизнеспособность лимфоцитов добавлением 0,2–0,5% раствора трипанового синего к взвеси лимфоци­тов в соотношении 1:1 (100 мкл + 100 мкл);

- развести комплемент (кролика или морской свинки) в соответствии с титром, указанным в инструкции;

- развести готовую (коммерческую) анти-Т-сыворотку сре­дой 199 до рабочей концентрации, указанной на этикетке.

2-й этап постановки ЦТТ:

- в лунки панели полистиролового планшета (или в цен­трифужной пробирке) смешать 60 мкл анти-Т-сыворотки в рабочем разведении, 20 мкл взвеси лимфоцитов, выде­ленной из исследуемых образцов и 20 мкл комплемента в рабочем разведении (опытные образцы);

- в контрольную лунку (пробирку) внести 20 мкл взвеси лимфоцитов, 20 мкл комплемента и 60 мкл среды 199 (контрольные образцы). Затем в каждую пробирку внести по 100 мкл трипанового синего и выдержать при комнат­ной температуре 30-60 с.

Учет результатов:

- подсчитать в камере Горяева количество погибших кле­ток в опыт-ных («ОП») и контрольных («К») образцах;

- высчитать их процент от общего количества клеток в препарате;

- высчитать процент погибших клеток в контроле;

- высчитать цитотоксический индекс (ЦТИ) по формуле:

ЦТИ = 100 х % погибших клеток «ОП» – %погибших клеток «К»
100 – % погибших клеток «К»

ЦТИ указывает на процент клеток, несущих Т-антигены, т.е. относительное количество Т-клеток.

У здоровых лиц ЦТИ составляет 70,6 + 0,9% (таблица 8).

Таблица 8

Возможные ошибки при проведении

лимфоцитотоксического теста

HLA- антигены идентифицируют двумя методами:

- в цитотоксическом тесте с лимфоцитами из периферической крови обследуемого и набором моноспецифических антисывороток к различным HLA- антигенам.

- в реакции смешанной культуры лимфоцитов. В основе реакции лежит феномен взаимной стимуляции синтеза ДНК в культуре лейкоцитов, различающихся по HLA- антигенам.

5.Определить совместимость антигенов донора и реципиента, если реципиент имеет генотип: А1, В8, DR3, A24, B57, DR5 (дать заключение, оформить протокол)

1. A1, B8, DR3, A29, B44, DR7

2. A3, B35, DR1, A24, B57, DR5

3. A3, B35, DR1, A29, B44, DR7

Заключение: донор №........

6. Определить присутствие антигенов HLA в лимфотоксическом тесте (записать в тетрадь, оформить протокол

В лимфотоксическом тесте получены следующие результаты (таблица 9):

Таблица 9

Оценка результатов лимфотоксического теста (табл.10):

Таблица 10

Заключение: на исследуемых клетках присутствуют антигены

Дата добавления: 2015-10-11 | Просмотры: 1484 | Нарушение авторских прав