АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Нормальный кариотип человека в митозе и мейозе

Митоз

Клеточный цикл. На рис. 2.4 представлена схема клеточного цикла делящейся клетки млекопитающих. Приведенные временные интервалы хотя и относятся конкретно к клеткам гепатомы крысы in vitro, но для других клеток они почти такие же. На стадии G ₁синтезируются белки и РНК, и клетка готовится к репликации ДНК, которая происходит в S-фазе. Как показали

Рис.2.4. Клеточный цикл делящейся клетки млекопитающего. В фазе G1 диплоидный набор хромосом (2n) представлен однократно. После синтеза ДНК(фаза S) диплоидный хромосомный набор удвоен (4n). М - митоз; заштрихованные столбики характеризуют содержание ДНК во время митоза. Подробности см. в тексте.	Рис.2.5. Сестринские хроматидные обмены в нормальной метафазе человека. Локализация обменов указана стрелками. (Courtesy of Dr. T.M.Schroeder-Kurth).

опыты с ³Н-тимидином, поступающим в клетку в разное время на протяжении S-фазы, различные участки хромосом реплицируются асинхронно. С помощью радиоавтографии можно идентифицировать те участки хромосом, которые еще не завершили репликацию и поэтому включают меченый предшественник ДНК. Во время фазы G₂, когда клетка готовится к митозу (М), происходит «внеплановый», или репаративный, синтез. На стадии G₁ материал каждой хромосомы диплоидного набора (2n) представлен однократно. На стадии G₂ каждая хромосома уже удвоена и два идентичных составляющих ее элемента называются сестринскими хроматидами. (Более правильным был бы термин «сестринские хромосомы», но терминология сложилась в то время, когда были известны только морфологические, а не биохимические аспекты митоза.) Поскольку материал каждой хромосомы теперь удвоен, то для клетки в целом имеет место (2 х 2n = 4n) ¹⁾. Во время и после репликации две сестринские хроматиды обмениваются сег-

¹ Строго говоря, это так, но ситуацию в G₂ принято обозначать в терминах числа хромосом как 2n = 46 и в терминах содержания ДНК как 4с ДНК. – Прим. ред.

42 2. Хромосомы человека

Рис. 2.6. Митоз. Изображены только 2 хромосомы из 46. (Buselmaier, 1976.)

ментами, так что обе хроматиды митотической хромосомы содержат участки другой хроматиды (сестринские хроматидные обмены, СХО). В этом можно убедиться с помощью специального окрашивания хромосом после обработки клеток аналогом тимидина – бромдезоксиуридином (БДУ) (рис. 2.5) [411].

Митоз. Фазы митоза изображены на рис. 2.6. Митоз начинается с момента конденсации хроматина (рис. 2.6, А; ранняя профаза). К концу профазы хромосомы становятся отчетливо видимыми, обе сестринские хроматиды тесно прилежат одна к другой. В этот момент ядерная мембрана растворяется, ядрышко исчезает и формируется веретено деления. Оно состоит из микротрубочек, в состав которых входит белок тубулин. Микротрубочки обнаруживаются под микроскопом как нити веретена. Они соединяют центромерные районы хромосом с полюсами веретена – центриолями. Профаза завершается исчезновением ядерной мембраны, клетка вступает в метафазу. Центромеры всех хромосом располагаются в экваториальной плоскости между двумя полюсами. Хроматиды каждой хромосомы начинают отделяться одна от другой, оставаясь соединенными только в центромерной области. Наконец разделяются и центромеры, и сестринские «полухромосомы» расходятся к противоположным полюсам с помощью нитей веретена. Функцию микротрубочек веретена можно продемонстрировать, обработав делящиеся клетки колхицином. Колхицин препятствует агрегации молекул тубулина, разрушает микротрубочки, что приводит к дезорганизации хромосом в экваториальной пластинке и подавлению их анафазного движения к полюсам, хотя собственно разделение хроматид происходит и в присутствии колхицина. В последней фазе митоза, телофазе, хромосомы деконденсируются, нити веретена дезинтегрируются (микротрубочки при этом сохраняются в клетке), образуется новая ядерная мембрана и начинается клеточное деление. Наиболее подходящей стадией для исследования хромосом является метафаза.

2.1.2.2. Приготовление и окрашивание препаратов метафазных хромосом [201; 88; 406]

Препараты хромосом можно приготовить из всех тканей и клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки. У человека в большинстве случаев используют препараты из клеток костного мозга, кратковременной культуры крови или из длительной культуры фибробластов. Наи-

2. Хромосомы человека 43

более простым и доступным является метод культивирования клеток крови. Пункция костного мозга или биопсия кожи для культивирования фибробластов технически сложнее, и к тому же аспирация костного мозга – весьма неприятная процедура. Препараты из костного мозга имеют, однако, то преимущество, что дают возможность изучать митозы in vivo.

В крови здоровых людей (или больных, но не лейкозами) нет делящихся клеток. Однако митоз этих клеток можно стимулировать искусственно, например обработав их фитогемагглютинином ФГА). Спустя один час после инкубации с ФГА в малых (Т-) лимфоцитах отмечается синтез РНК, а через 24 ч начинается синтез ДНК. Суспензию лейкоцитов выращивают в культуральной среде 72 ч и затем готовят препараты хромосом. Чтобы остановить клетки в прометафазе, подавляют образование веретена деления веществами с колхициноподобным действием, предпочтительно колцемидом. В специальных условиях время культивирования можно сократить до 48 ч. Для свободного распределения хромосом в плоскости препарата клетки обрабатывают в течение 10-30 мин гипотоническим раствором, а затем фиксируют смесью этанола и уксусной кислоты. Каплю такой суспензии наносят на стекло, высушивают на воздухе и окрашивают.

Препараты клеток костного мозга получают из материала пункции грудины или подвздошной кости. Клетки культивируют только 2 ч с колцемидом. Процедура приготовления препаратов несколько отличается от процедуры, описанной выше. Культуру фибробластов получают из материала биопсии кожи. Ее измельчают и выращивают в культуральной среде таким образом, чтобы кусочки были прикреплены к поверхности культурального сосуда. Через 10 дней клетки начинают расти по этой поверхности, через 21 день готовят суспензию и делают препараты.

Окрашивание. Наиболее простой способ окрашивания—красителем Гимза или 2%-ным ацетоорсеином, или 2%-ным ацеткармином. Эти красители окрашивают хромосомы целиком, равномерно и интенсивно. Для некоторых диагностических целей (например, для выявления численных аномалий хромосом) этот метод вполне достаточен. Для получения более детальной картины структуры хромосом и идентификации отдельных хромосом или их сегментов используются различные способы дифференциального окрашивания.

Дифференциальное окрашивание. Многие исследователи отмечали в хромосомах, окрашенных по обычной методике, некоторую неоднородность в плотности окрашивания отдельных участков. Этот факт оставался без внимания, пока Касперсон с сотр. (1968) [320] не обнаружили, что после обработки акрихин-ипритом флуоресценция по длине хромосомы распределена не равномерно, а в виде сегментов. Затем Касперсон с сотр. показали, что каждую хромосому человека можно надежно идентифицировать с помощью такого метода окрашивания. Вскоре после этого стало ясно, что очень сходный рисунок сегментации можно получить и с помощью красителя Гимза, если дополнить процедуру окрашивания некоторыми приемами. Многие исследователи предложили методики для окрашивания прицентромерных районов. Было показано, что частичная тепловая денатурация также приводит к выявлению сегментов в хромосомах. На Парижской конференции по стандартизации и номенклатуре хромосом человека в 1971 г. [468] полученные к тому времени данные были сопоставлены, и оказалось, что все методы выявляют в принципе одни и те же структуры, но каждый из них специфичен в отношении определенных хромосомных сегментов.

Общепринятые методы [341; 200]. Различные типы сегментов обозначают по методам, с помощью которых они выявляются наиболее отчетливо:

а) Q-сегменты (quinacrine, акрихин)-участки хромосом, флуоресцирующие после окрашивания акрихин-ипритом или сходными соединениями.

б) G-сегменты (Giemsa, Гимза) выявляются при окрашивании красителем Гимза в сочетании с дополнительными процедурами, которые способствуют тому, что краситель адсорбируется наиболее интенсивно на определенных участках. Q- и G-сегменты идентичны. В большинстве лабораторий в повседневной работе предпочитают G-метод, поскольку он не требует использования флуоресцентного микроскопа и окрашенные препараты можно длительно хранить. Однако специфическое преимущество Q-метода состоит в том, что он позволяет даже в интерфазном ядре идентифицировать Y-хромосому человека по яркой флуоресценции.

в) R-сегменты (reverse, обратные) окрашиваются после контролируемой тепловой денатурации. Они располагаются между Q(или G-) сегментами.

г) С-сегменты (constitutive heterochromatin, конститутивный гетерохроматин) ограничивают прицентромерные районы в обоих плечах хромосомы.

44 2. Хромосомы человека

Рис.2.7. Окрашивание серебром (стрелки) районов ядрышковых организаторов акроцентрических хромосом. (Courtesy of Dr.T. M.Schroeder-Kurth.)

д) Т-сегменты (telomeric, теломерные) расположены в теломерных районах хромосом. Детальное описание этих методов можно найти в многочисленных публикациях. Многие лаборатории используют свои собственные модификации.

Химические различия, выявляемые методами дифференциального окрашивания. Природа химических различий, выявляемых этими методами, еще только исследуется. Обычно обсуждаются две основные гипотезы: так называемая ДНК-вая и белковая. Первая исходит из данных о том, что различные участки хромосом человека отличаются по количественному содержанию А—Т (аденин—тимин) и G—С (гуанин— цитозин) пар оснований. Акрихин-иприт связывается преимущественно с АТ-богатыми участками [466, 341]. Акридиновый оранжевый, соединяясь с одноцепочечной ДНК, дает красную флуоресценцию. После контролируемой денатурации R-сегменты окрашиваются в красный цвет. На основании этих данных можно предложить следующую гипотезу:

а) Q-сегменты соответствуют участкам, богатым А—Т-парами.

б) R-сегменты соответствуют участкам, богатым G—С-парами, которые более устойчивы к тепловой денатурации, чем А—Т-богатые участки.

Эта гипотеза не объясняет, однако, все особенности рисунка сегментации. С другой стороны, белковая гипотеза исходит из данных о том, что протеолитическая обработка индуцирует появление G-сегментов. Но поскольку разные ДНК связаны в хромосомах с разными белками, можно полагать, что рисунок сегментации тем или иным образом зависит от особенностей целостного комплекса ДНК—белок.

Окрашивание серебром районов ядрышкового организатора (ЯОР) [363, 511, 518]. Метод серебрения специфичен для ядрышкообразующих районов. Они видны как темные пятна на желтокоричневом фоне хромосом (рис. 2.7). При этом окрашиваются только те ЯОР, которые функционировали в предшествующей интерфазе.

2. Хромосомы человека 45

Хромосомы в сперматозоидах человека. Несколько лет назад был предложен метод приготовления препаратов хромосом непосредственно из сперматозоидов человека. Для этого сперму сначала инкубировали с ооцитами золотистого хомячка, лишенными блестящей оболочки, чтобы индуцировать митозы [489]. Этот метод весьма важен для прямого определения хромосомных аномалий в сперматозоидах человека. Однако его воспроизводимость очень плохая [431]. В одном исследовании частота хромосомных аномалий в сперматозоидах оказалась равной 8,5% [432].

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 771 | Нарушение авторских прав