АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Уникальная и повторяющаяся ДНК

Избыточность ДНК в геноме человека. Вскоре после того, как генетический код был расшифрован (в начале 60-х гг.), ученые пришли к выводу об избыточности ДНК в эукариотических клетках. По данным разных авторов, содержание ДНК в диплоидной клетке человека составляет примерно 7,3·10^–12 г (размах от 6,6 до 8,0). Зная мол. массу оснований, можно подсчитать, что нуклеотидная пара А-Т (аденин—тимин) имеет массу 1,025·10^–21 г, а нуклеотидная пара G—С (гуанин—цитозин) – 1,027·10^–21 г. Следовательно, весь диплоидный набор содержит приблизительно 7,1·10⁹ нуклеотидных пар:

Если вся эта ДНК входит в состав структурных генов, кодирующих белки, а средний белок, подобно гемоглобину, состоит примерно из 150 аминокислот, то человеческий геном должен содержать примерно 6-7 млн. генов [1338; 1339]. В настоящее время известно, что эта цифра завышена примерно на два порядка. «Информативная» (кодирующая) ДНК чередуется с последовательностями, которые не транслируются в аминокислотные последовательности. Некоторые из них имеют какие-то специфические функции, для других функции до сих пор не обнаружены.

Факты, свидетельствующие об избыточности ДНК в клетках эукариот, были известны и раньше. Например, при изучении гигантских хромосом Drosophila и Chironomus оказалось, что диски в этих хромосомах имеют среднюю длину 20 000 – 50 000 нуклеотидных пар (20–50 т.п.н.). С другой стороны, данные генетического анализа свидетельствуют о том, что один диск (+ междиск) в норме содержит только один ген [1042]. Прямой анализ генома человека, однако, нуждается в новых методах.

2. Хромосомы человека 115

Повторяющаяся ДНК [1317; 509; 409]. Большую роль в развитии представлений о структуре генома сыграло открытие того, что ДНК высших организмов содержит большую фракцию повторяющихся последовательностей. Выделенную из клеток высокомолекулярную ДНК можно фрагментировать на отрезки примерно одинаковой длины, а затем такие короткие двухцепочечные структуры денатурировать, т. е. разделить на одноцепочечные с помощью нагревания в солевом растворе. В таком растворе одноцепочечные фрагменты могут свободно перемещаться и случайно сталкиваться один с другим. При резком понижении температуры они, встречаясь с комплементарными партнерами, будут формировать двойные спирали ДНК. В этом состоит простой метод установления комплементарности цепей ДНК.

Если бактериальную ДНК подвергнуть тепловой денатурации указанным образом, а затем идентифицировать фракцию реассоциировавшей после отжига двухцепочечной ДНК по исходной концентрации молекул С₀ и времени реакции (t), то получается линейная зависимость (на логарифмическом графике этому соответствуют S-образная кривая, C₀t-кривая) (рис. 2.78). Если провести такой эксперимент с фрагментами человеческой ДНК длиной примерно в 600 пар оснований, то кривая будет совершенно другая. Сразу же после начала отжига обнаруживается небольшой процент реассоциировавшей двухцепочечной ДНК. Крутой наклон кривой показывает, что следующая фракция ДНК отжигается примерно в 50000 раз быстрее, чем бактериальная ДНК; еще одна фракция ДНК отжигается быстрее бактериальной в 10-1000 раз. Остальная ДНК (≈ 50%) характеризуется такой же кинетикой, как и бактериальная. Эти данные можно объяснять следующим образом: небольшая часть ДНК человека имеет области, в которых комплементарные последовательности располагаются на одной и той же цепи, но в обратном порядке (палиндром). Эта ДНК может реассоциировать очень быстро, просто складываясь вместе. Другая фракция содержит повторяющиеся последовательности, которые реассоциируют, образуя двухцепочечную

Рис. 2.78. Кинетика отжига фрагментов ДНК разной длины у бактерии и человека. Указана доля (%) двухцепочечной, реассоциированной ДНК для разных концентраций продукта ДНК (С0) и времени (t). Пунктирная S-образная кривая соответствует бактериальной ДНК и характерна для уникальной фракции. Точечная кривая – профиль реассоциации фрагментов ДНК человека длиной в 600 оснований. Можно выделить четыре класса: 9% имеют неизмеримо быструю скорость отжига; 22% характеризуются C0tl/2=10–2; 12,5%-C0tl/2= 1,0 и 51,2%C0t1/2 = 495. C0tl/2 = 10–2 означает, что отжиг происходит примерно в 50 000 раз быстрее, чем при C0tl/2 = 495. Нижняя кривая показывает кинетику реакции фрагментов длиной 1,3 т.п.н. Они реассоциируют намного быстрее. Это означает, что большинство сегментов содержит повторяющиеся последовательности. Только около 10% ДНК ведет себя как уникальная. (Данные Schmid, Deininger, 1975; рисунок из [499].)

ДНК; в данном случае скорость реассоциации зависит от числа идентичных (или почти идентичных) повторов. Наконец, имеются еще уникальные последовательности ДНК (единичные копии), кинетика реассоциации которых сходна с таковой для бактериальной ДНК (рис. 2.78).

Как уникальные и повторяющиеся последовательности ДНК расположены относительно друг друга? В разных работах показано, что несколько больше 50% ДНК генома человека представлено уникальными фрагментами длиной около 2 т.п.н. Они распределены в основном между умеренно повторяющимися последовательностя-

116 2. Хромосомы человека

ми, длина которых составляет 0,3 т.п.н. Многие из этих повторяющихся последовательностей весьма сходны друг с другом. Кроме того, высокоповторяющиеся последовательности ДНК, образованные миллионами копий коротких олигонуклеотидов, были обнаружены в таких специфических районах, как центромерная область или длинное плечо Y-хромосомы. Высокоповторяющаяся ДНК часто демонстрирует индивидуальные количественные и качественные различия, не влияющие, однако, на фенотип. Уникальная ДНК включает в себя структурные гены, но лишь небольшая часть этой ДНК представлена структурными генами. Описанная топология последовательностей очень широко распространена и наблюдается даже у весьма отдаленных видов, таких, как млекопитающие, амфибии, гастроподы и даже жгутиковые [509]. Широкое распространение относительно стабильного паттерна предполагает какую-то важную его функцию, которая, к сожалению, пока не выявлена. У некоторых видов, например у Drosophila melanogaster и Chironomus tentans, подобное распределение коротких последовательностей ДНК не обнаружено.

Повторяющиеся последовательности ДНК со специфическими функциями. Некоторые умеренно повторяющиеся последовательности содержат гены, необходимые всем клеткам в каждой фазе индивидуального развития (рибосомной РНК, гистонов, транспортной РНК). Как правило, гены рибосомной РНК (рРНК) являются частью района ядрышкового организатора, а само ядрышко содержит пул рРНК. У человека районы ядрышковых организаторов расположены в коротком плече акроцентрических хромосом (13-15; 21; 22). Для определения числа генов рРНК у человека был использован метод гибридизации РНК ДНК in vitro [1021; 1022]. По соотношению объема фракции ДНК, гибридизующейся с рРНК, с общим содержанием ДНК в ядрах клеток человека, было определено среднее число копий рибосомных генов в диплоидной клетке. Оно оказалось равным приблизительно 416-443.

Рис. 2.79. Сателлитная ДНК человека: аналитическое ультрацентрифугирование тотальной плацентарной ДНК в градиенте плотности сульфата цезия в присутствии ионов серебра свидетельствует о наличии сателлитов I (1, 444), II (1,451), и III (1,509). (По Miklos and John, Amer. J.Hum. Genet., 31, p. 266, 1979.)

Мульгигенное семейство, образованное многочисленными генами вариабельных участков иммуноглобулинов (разд. 4.4), включает столь большое количество копий, что соответствующие последовательности ДНК можно отнести к классу умеренно повторяющихся. В разд. 2.3.6.7 описываются другие мультигенные семейства, часть из которых может входить в повторяющуюся фракцию.

Сателлитная ДНК. Многие виды ДНК, особенно относящиеся к фракциям высокоповторяющихся последовательностей, характеризуются как сателлитная ДНК. При центрифугировании фрагментированной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия выявляется основная полоса или пик. По обе стороны от основного пика часто видны маленькие пики. Соответствующая им ДНК и называется сателлитной. Количество и локализация пиков сателлитной ДНК видоспецифичны (рис. 2.79). Локализация пиков в градиенте плотности хлористого цезия определяется нуклеотидным составом последовательностей. Отдельный пик может стать заметным только в том случае, если состав этой фракции отличается от состава основной фракции ДНК. В хромосомах сателлитная ДНК обычно соответствует конститутивному гетерохроматину. У человека она находится также вне центромерной области в Y-xpoмосоме и в хромосомах 1, 9 и 16. Она

2. Хромосомы человека 117

состоит из коротких высокоповторяющихся последовательностей, которые могут быть представлены несколькими миллионами копий. (Сателлитную ДНК не следует путать с сателлитными районами акроцентрических хромосом. Использование одного и того же термина является неудачным совпадением.) Сравнение фракций сателлитной ДНК человека и других видов, особенно высших обезьян, весьма важно для понимания эволюции человека. Функция сателлитной ДНК неизвестна и является предметом дискуссий. Например, предполагают, что сателлитная ДНК участвует в распознавании гомологичных хромосом во время мейотической конъюгации или модулирует некоторые регуляторные функции генов. Пока нет убедительных доказательств в пользу той или иной гипотезы. Однако исследования на дрозофиле свидетельствуют о влиянии сателлитной ДНК на кроссинговер [437]. Открытие сателлитной ДНК удивило цитогенетиков тем, что она оказалась локализованной в той части хроматина, которая по данным микроскопического анализа уже многие десятилетия идентифицировалась как гетерохроматин. Относительно недавних открытых «мини-сателлитных» последовательностей ДНК см. разд. 2.3.2.7.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1080 | Нарушение авторских прав