АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология
|
Уникальная и повторяющаяся ДНК
Избыточность ДНК в геноме человека. Вскоре после того, как генетический код был расшифрован (в начале 60-х гг.), ученые пришли к выводу об избыточности ДНК в эукариотических клетках. По данным разных авторов, содержание ДНК в диплоидной клетке человека составляет примерно 7,3·10–12 г (размах от 6,6 до 8,0). Зная мол. массу оснований, можно подсчитать, что нуклеотидная пара А-Т (аденин—тимин) имеет массу 1,025·10–21 г, а нуклеотидная пара G—С (гуанин—цитозин) – 1,027·10–21 г. Следовательно, весь диплоидный набор содержит приблизительно 7,1·109 нуклеотидных пар:
Если вся эта ДНК входит в состав структурных генов, кодирующих белки, а средний белок, подобно гемоглобину, состоит примерно из 150 аминокислот, то человеческий геном должен содержать примерно 6-7 млн. генов [1338; 1339]. В настоящее время известно, что эта цифра завышена примерно на два порядка. «Информативная» (кодирующая) ДНК чередуется с последовательностями, которые не транслируются в аминокислотные последовательности. Некоторые из них имеют какие-то специфические функции, для других функции до сих пор не обнаружены.
Факты, свидетельствующие об избыточности ДНК в клетках эукариот, были известны и раньше. Например, при изучении гигантских хромосом Drosophila и Chironomus оказалось, что диски в этих хромосомах имеют среднюю длину 20 000 – 50 000 нуклеотидных пар (20–50 т.п.н.). С другой стороны, данные генетического анализа свидетельствуют о том, что один диск (+ междиск) в норме содержит только один ген [1042]. Прямой анализ генома человека, однако, нуждается в новых методах.
2. Хромосомы человека 115
Повторяющаяся ДНК [1317; 509; 409]. Большую роль в развитии представлений о структуре генома сыграло открытие того, что ДНК высших организмов содержит большую фракцию повторяющихся последовательностей. Выделенную из клеток высокомолекулярную ДНК можно фрагментировать на отрезки примерно одинаковой длины, а затем такие короткие двухцепочечные структуры денатурировать, т. е. разделить на одноцепочечные с помощью нагревания в солевом растворе. В таком растворе одноцепочечные фрагменты могут свободно перемещаться и случайно сталкиваться один с другим. При резком понижении температуры они, встречаясь с комплементарными партнерами, будут формировать двойные спирали ДНК. В этом состоит простой метод установления комплементарности цепей ДНК.
Если бактериальную ДНК подвергнуть тепловой денатурации указанным образом, а затем идентифицировать фракцию реассоциировавшей после отжига двухцепочечной ДНК по исходной концентрации молекул С0 и времени реакции (t), то получается линейная зависимость (на логарифмическом графике этому соответствуют S-образная кривая, C0t-кривая) (рис. 2.78). Если провести такой эксперимент с фрагментами человеческой ДНК длиной примерно в 600 пар оснований, то кривая будет совершенно другая. Сразу же после начала отжига обнаруживается небольшой процент реассоциировавшей двухцепочечной ДНК. Крутой наклон кривой показывает, что следующая фракция ДНК отжигается примерно в 50000 раз быстрее, чем бактериальная ДНК; еще одна фракция ДНК отжигается быстрее бактериальной в 10-1000 раз. Остальная ДНК (≈ 50%) характеризуется такой же кинетикой, как и бактериальная. Эти данные можно объяснять следующим образом: небольшая часть ДНК человека имеет области, в которых комплементарные последовательности располагаются на одной и той же цепи, но в обратном порядке (палиндром). Эта ДНК может реассоциировать очень быстро, просто складываясь вместе. Другая фракция содержит повторяющиеся последовательности, которые реассоциируют, образуя двухцепочечную
| Рис. 2.78. Кинетика отжига фрагментов ДНК разной длины у бактерии и человека. Указана доля (%) двухцепочечной, реассоциированной ДНК для разных концентраций продукта ДНК (С0) и времени (t). Пунктирная S-образная кривая соответствует бактериальной ДНК и характерна для уникальной фракции. Точечная кривая – профиль реассоциации фрагментов ДНК человека длиной в 600 оснований. Можно выделить четыре класса: 9% имеют неизмеримо быструю скорость отжига; 22% характеризуются C0tl/2=10–2; 12,5%-C0tl/2= 1,0 и 51,2%C0t1/2 = 495. C0tl/2 = 10–2 означает, что отжиг происходит примерно в 50 000 раз быстрее, чем при C0tl/2 = 495. Нижняя кривая показывает кинетику реакции фрагментов длиной 1,3 т.п.н. Они реассоциируют намного быстрее. Это означает, что большинство сегментов содержит повторяющиеся последовательности. Только около 10% ДНК ведет себя как уникальная. (Данные Schmid, Deininger, 1975; рисунок из [499].)
|
ДНК; в данном случае скорость реассоциации зависит от числа идентичных (или почти идентичных) повторов. Наконец, имеются еще уникальные последовательности ДНК (единичные копии), кинетика реассоциации которых сходна с таковой для бактериальной ДНК (рис. 2.78).
Как уникальные и повторяющиеся последовательности ДНК расположены относительно друг друга? В разных работах показано, что несколько больше 50% ДНК генома человека представлено уникальными фрагментами длиной около 2 т.п.н. Они распределены в основном между умеренно повторяющимися последовательностя-
116 2. Хромосомы человека
ми, длина которых составляет 0,3 т.п.н. Многие из этих повторяющихся последовательностей весьма сходны друг с другом. Кроме того, высокоповторяющиеся последовательности ДНК, образованные миллионами копий коротких олигонуклеотидов, были обнаружены в таких специфических районах, как центромерная область или длинное плечо Y-хромосомы. Высокоповторяющаяся ДНК часто демонстрирует индивидуальные количественные и качественные различия, не влияющие, однако, на фенотип. Уникальная ДНК включает в себя структурные гены, но лишь небольшая часть этой ДНК представлена структурными генами. Описанная топология последовательностей очень широко распространена и наблюдается даже у весьма отдаленных видов, таких, как млекопитающие, амфибии, гастроподы и даже жгутиковые [509]. Широкое распространение относительно стабильного паттерна предполагает какую-то важную его функцию, которая, к сожалению, пока не выявлена. У некоторых видов, например у Drosophila melanogaster и Chironomus tentans, подобное распределение коротких последовательностей ДНК не обнаружено.
Повторяющиеся последовательности ДНК со специфическими функциями. Некоторые умеренно повторяющиеся последовательности содержат гены, необходимые всем клеткам в каждой фазе индивидуального развития (рибосомной РНК, гистонов, транспортной РНК). Как правило, гены рибосомной РНК (рРНК) являются частью района ядрышкового организатора, а само ядрышко содержит пул рРНК. У человека районы ядрышковых организаторов расположены в коротком плече акроцентрических хромосом (13-15; 21; 22). Для определения числа генов рРНК у человека был использован метод гибридизации РНК ДНК in vitro [1021; 1022]. По соотношению объема фракции ДНК, гибридизующейся с рРНК, с общим содержанием ДНК в ядрах клеток человека, было определено среднее число копий рибосомных генов в диплоидной клетке. Оно оказалось равным приблизительно 416-443.
| Рис. 2.79. Сателлитная ДНК человека: аналитическое ультрацентрифугирование тотальной плацентарной ДНК в градиенте плотности сульфата цезия в присутствии ионов серебра свидетельствует о наличии сателлитов I (1, 444), II (1,451), и III (1,509). (По Miklos and John, Amer. J.Hum. Genet., 31, p. 266, 1979.)
|
Мульгигенное семейство, образованное многочисленными генами вариабельных участков иммуноглобулинов (разд. 4.4), включает столь большое количество копий, что соответствующие последовательности ДНК можно отнести к классу умеренно повторяющихся. В разд. 2.3.6.7 описываются другие мультигенные семейства, часть из которых может входить в повторяющуюся фракцию.
Сателлитная ДНК. Многие виды ДНК, особенно относящиеся к фракциям высокоповторяющихся последовательностей, характеризуются как сателлитная ДНК. При центрифугировании фрагментированной ДНК в градиенте плотности хлористого цезия выявляется основная полоса или пик. По обе стороны от основного пика часто видны маленькие пики. Соответствующая им ДНК и называется сателлитной. Количество и локализация пиков сателлитной ДНК видоспецифичны (рис. 2.79). Локализация пиков в градиенте плотности хлористого цезия определяется нуклеотидным составом последовательностей. Отдельный пик может стать заметным только в том случае, если состав этой фракции отличается от состава основной фракции ДНК. В хромосомах сателлитная ДНК обычно соответствует конститутивному гетерохроматину. У человека она находится также вне центромерной области в Y-xpoмосоме и в хромосомах 1, 9 и 16. Она
2. Хромосомы человека 117
состоит из коротких высокоповторяющихся последовательностей, которые могут быть представлены несколькими миллионами копий. (Сателлитную ДНК не следует путать с сателлитными районами акроцентрических хромосом. Использование одного и того же термина является неудачным совпадением.) Сравнение фракций сателлитной ДНК человека и других видов, особенно высших обезьян, весьма важно для понимания эволюции человека. Функция сателлитной ДНК неизвестна и является предметом дискуссий. Например, предполагают, что сателлитная ДНК участвует в распознавании гомологичных хромосом во время мейотической конъюгации или модулирует некоторые регуляторные функции генов. Пока нет убедительных доказательств в пользу той или иной гипотезы. Однако исследования на дрозофиле свидетельствуют о влиянии сателлитной ДНК на кроссинговер [437]. Открытие сателлитной ДНК удивило цитогенетиков тем, что она оказалась локализованной в той части хроматина, которая по данным микроскопического анализа уже многие десятилетия идентифицировалась как гетерохроматин. Относительно недавних открытых «мини-сателлитных» последовательностей ДНК см. разд. 2.3.2.7.
Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 1075 | Нарушение авторских прав
|