АкушерствоАнатомияАнестезиологияВакцинопрофилактикаВалеологияВетеринарияГигиенаЗаболеванияИммунологияКардиологияНеврологияНефрологияОнкологияОториноларингологияОфтальмологияПаразитологияПедиатрияПервая помощьПсихиатрияПульмонологияРеанимацияРевматологияСтоматологияТерапияТоксикологияТравматологияУрологияФармакологияФармацевтикаФизиотерапияФтизиатрияХирургияЭндокринологияЭпидемиология

Сортировка хромосом при помощи цитофлуорометрии

Зачем нужны сортировка хромосом и препараты отдельных хромосом? Сортировка хромосом методом цитофлуорометрии используется в двух разных целях: 1) для идентификации и количественного анализа рисунка флуоресценции большого числа хромосом в течение очень короткого времени; 2) для препаративного разделения хромосом. Этот метод имеет два преимущества перед стандартными методами анализа хромосом: он автоматический, благодаря чему исключается элемент субъективности, и он намного быстрее. Например, некоторые хромосомные аберрации настолько малы, что их невозможно обнаружить обычными методами, но при определенных условиях они идентифицируются с помощью цитофлуорометрии.

Однако важнее, что этот метод позволяет препаративно разделять хромосомы, и при наличии специфических зондов исследовать структуру и функцию отдельных генов становится относительно просто. В этом случае ген можно локализовать в хромосоме с помощью гибридизации in situ, размножить его ДНК путем клонирования и секвенировать. Можно исследовать таким же образом и генетический материал некодирующих участков гена. Основой для такого рода исследований являются геномные библиотеки ДНК. Однако их неудобство состоит в том, что обычно трудно или невозможно отобрать из огромного количества фрагментов интересующие нас последовательности. Кроме того, изучение распределения ДНК по различным хромосомам нередко само по себе является важным предметом исследования. Для такого рода работ необходимы библиотеки ДНК отдельных хромосом или даже их отдельных фрагментов.

132 2. Хромосомы человека

Рис. 2.88. Принцип сортировки хромосом с помощью лазера. Хромосомы окрашены флуоресцирующим красителем. Флуоресценция возбуждается лазерным лучом и измеряется для каждой хромосомы отдельно. Данные измерений используют для сортировки хромосом. (Courtesy of Dr.C. Gremer.)

Физический принцип [364] становится ясен из рис. 2.88. На нем изображена однолучевая система, но используют также и двулучевые системы, в которых применяются два разных пучка света. Для анализа с помощью двулучевой системы хромосомы окрашивают двумя красителями с максимумом флуоресценции при разных длинах волн. Затем митотические хромосомы отделяют от остального клеточного материала и помещают в систему. Их «прогоняют» одну за другой через заполненную водой измерительную часть устройства, где они последовательно освещаются двумя лазерными пучками (например, одним ультрафиолетовым, а другим - видимым светом с длиной волны 459 нм). Два типа флуоресценции, возникающей в точке пересечения потока хромосом и лазерного пучка, собираются линзой и проецируются на отдельные фотоумножители, благодаря чему можно построить двумерное изображение (рис. 2.89) по двум одномерным для каждого красителя и длины волны. В опыте, представленном на рис. 2.89, были подобраны два таких красителя: один из них окрашивал районы, представленные в основном А—Т-парами, а другой - районы с преимущественным содержанием G—С-пар. Система может включать приспособление, которое позволяет менять направление потока хромосом в зависимости от рисунка флуоресценции. С помощью такого метода получают относительно чистые препараты отдельных групп морфологически сходных хромосом и даже отдельных хромосом.

Сортировка Х- и Y-хромосом. В работе [333, 330] осуществлена препаративная проточная цитофотометрия Х- и Y-хромосом человека. Х-хромосома была выделена из клеточной линии с кариотипом 48,ХХХХ с помощью однолучевой сортировки. Этот материал был использован для приготовления библиотеки хромосомной ДНК после обработки рестриктазой EcoRl и клонирования в фаге X, (см. разд. 2.3.2.2). Y-хромосома отобрана с помощью двулучевого сортера из материала гибридной клеточной линии «китайский хомячок х человек». Получение клеточных гибридов будет описано в разд. 3.4.3 в связи с локализацией генов в хромосомах. Важная особенность гибридных клеток человек х мышь или

2. Хромосомы человека 133

человек х хомячок состоит в том, что при их размножении утрачиваются преимущественно хромосомы человека. Таким путем была получена клеточная линия, которая имела полный набор хромосом хомячка и только У-хромосому человека. Поскольку все хромосомы хомячка отличаются от хромосомы человека в большей степени, чем сами хромосомы человека между собой, такие клеточные гибриды особенно под-

Рис. 2.89.Контурный график (интенсивность флуоресценции) двумерной лазерной сортировки хромосом из гибридных клеток «китайский хомячок х человек», в которых осталась только человеческая У-хромосома. Буквы А-К относятся к разным хромосомам хомячка; буква L указывает на Y-хромосому человека. А. Все хромосомы; Б. Только маленькие хромосомы. (По [330].)

ходят для сортировки. На рис. 2.89 показаны пики на двумерной картине: хромосома, помеченная буквой L-это Y-хромосома человека. Она отделена от остальных настолько четко, что из этого материала можно получить библиотеку ДНК этой хромосомы.

2.3.3.6. Анализ β-глобинового гена и обобщение опыта исследования одного гена.

β -глобиновый ген. Разд. 2.3.2.1 начинался с анализа структуры β-глобинового гена, которая была раскрыта благодаря использованию новых методов и подходов. Наиболее важные из них описаны в предыдущем разделе, однако теперь мы снова вернемся к анализу данного гена.

Как уже говорилось, первым этапом является идентификация этого гена в необозримом «море» человеческой ДНК. Для этого ее выделяют из клеток, затем рестрицируют. Образовавшиеся фрагменты разделяют по длине с помощью агарозного гель-электрофореза. Фракционированные фрагменты денатурируют и переносят на нитроцеллюлозные фильтры методом блотинга (промакивания) по Саузерну, в результате чего на фильтре ДНК представлена уже в одноцепочечной форме и фиксирована. Следующий шаг состоит в идентификации фрагмента ДНК, содержащего β-глобиновый ген. Для этого необходим радиоактивный ДНК-зонд, который синтезируется на β-глобиновой мРНК с помощью обратной транскриптазы (мРНК → кДНК). Этот кДНК-зонд можно использовать теперь для гибридизации с геномной ДНК прямо на фильтре. Радиоавтография позволяет обнаружить фрагменты, содержащие глобиновый ген.

Данный метод пригоден и для локализации β-глобинового гена с помощью гибридизации in situ, как описано в разд. 2.3.2.3 на примере гена тяжелой цепи миозина. Ген Нbβ был локализован таким способом в коротком плече хромосомы 11 (Пр; см. разд. 4.3). Для более подробной характеристики β-глобинового гена необходимо получить большое количество его ДНК, что достигается с помощью клонирования кДНК в каком-нибудь векторе, например в

134 2. Хромосомы человека

бактериальной плазмиде (см. разд. 2.3.2.2). Анализ семейства β-глобиновых генов проводили, сравнивая последовательности геномной ДНК в транскрибируемой области с кДНК методами электронной микроскопии; по данным секвенирования геномной ДНК внутри и вне транскрибируемых последовательностей; с помощью идентификации сигнальных последовательностей. Первый и наиболее впечатляющий результат состоял в обнаружении с помощью электронной микроскопии того факта, что геномная β-глобиновая ДНК и кДНК не совпадают по длине и при гибридизации образуют характерные петли [1329]. Последние формируются за счет тех участков геномной ДНК, которые отсутствуют в кДНК и, следовательно, не транскрибируются, поскольку кДНК является точной копией мРНК. В гене Нbβ были выявлены две такие вставочные последовательности (интроны), которые разделяют три разные кодирующие области (экзоны). Исследования, проведенные на многих других эукариотических генах, показали, что наличие интронов является скорее правилом, чем исключением. Этим гены эукариот существенно отличаются от бактериальных и вирусных генов, у которых транскрипция по всей длине одного гена не прерывается. Часто экзоны представляют собой функциональные субъединицы гена. Они могут возникать в ходе эволюции (разд. 7.2.3) как результат объединения нескольких самостоятельных генов.

Эти и более поздние исследования подтвердили выводы, сделанные на основании семейных данных об аномальных гемоглобинах (разд. 4.3.2), согласно которым имеется только один функциональный ген Нbβ, тогда как, например, гены α и γ-глобинов дуплицированы. Однако молекулярные исследования позволили выявить еще и псевдогены, они сходны с последовательностями ДНК функциональных генов, но не транскрибируются вследствие мутаций в кодирующих или фланкирующих участках. На рис. 4.44 показана область Нbβ. Кроме этого гена и его псевдогена имеются два γ-гена, один δ-ген (для δ-полипептидной цепи, входящей в состав НbА₂) и гены ранних эмбриональных глобинов. Молекулярный анализ подтвердил выводы относительно структуры этой генной области, полученные на основании формально-генетического анализа и биохимии гемоглобинов (разд. 4.3), но одновременно дал много совершенно новой информации о структуре и функциональной организации эукариотических генов как таковых.

Специальные исследования помогли ответить и на вопрос о том, как происходит транскрипция и как образуется зрелая мРНК (рис. 2.90). Выяснилось, что сначала транскрибируется весь ген, включая интроны и фланкирующие последовательности, расположенные дистальнее кодирующей области. Затем участки транскрипта, соответствующие интронам, вырезаются, 5'-конец «кэпируется» (блокируется 5-метилцитозином), а 3'-конец защищается poly А-последовательностью. Наконец, мРНК, претерпевшая такой процессинг (созревание), покидает ядро, переходит в рибосомы и используется как матрица для биосинтеза белка. Сейчас известны последовательности ДНК различных глобиновых генов. Изучение этих генов позволило решить много общих проблем, касающихся организации и экспрессии генетического материала в клетке. Вопросы, связанные с полиморфизмом глобиновых генов на генетическом, клиническом, белковом уровнях и на уровне ДНК, рассматриваются в разд. 4.3. Ряд аспектов мутационного про-

Рис. 2.90. Единичная нуклеотидная цепь ДНК с характерной специфической последовательностью оснований. На 5'-конце, где начинается транскрипция, обозначены два характерных участка: СААТ и ТАТА (80 и 30 п. н.). По аналогии с бактериальным геномом предполагают, что последовательность СААТ служит сайтом узнавания для РНК-полимеразы, а участок ТАТА является промоторным для индуцируемой полимеразой транскрипции. ДНК транскрибируется в комплементарную последовательность РНК, включая интроны. Затем РНК подвергается процессингу, интроны удаляются, 5'-конец «кэпируется», а 3'-конец закрывается последовательностью poly А. После этого созревшая мРНК проходит через ядерную мембрану и прикрепляется к рибосоме, где генетическая информация транслируется в белковую последовательность.

2. Хромосомы человека 135

цесса будет обсуждаться в разд. 5.1.4.3, а эволюционные аспекты-в разд. 7.2.3.

Дата добавления: 2015-12-16 | Просмотры: 527 | Нарушение авторских прав